G-四链体探针用于重金属和端粒酶的非标记荧光检测

摘要

重金属污染是由重金属或其化合物造成的环境污染，随着工业化进程的加快，重金属对环境的破坏日益严重。作为一种危险的污染物，重金属往往长期积累在生物体内而不能得到降解。即使是在极其微量的情况下，重金属离子也会对生态系统造成不同程度的危害。铅、汞等重金属离子具有很大的毒性，时刻威胁着人类的健康。目前，传感器技术在重金属检测中发挥着重要作用，在环境检测和生命科学领域，对这些金属离子进行定性和定量的检测有着非常重要的意义。
　　端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，可以与端粒末端结合并刺激端粒的延伸。因为端粒酶诱导的端粒延伸补偿了细胞正常分裂中端粒的缩短，从而导致细胞的恶性无限增值。研究表明绝大多数癌细胞中都发现端粒酶的含量过高，因此，端粒酶可以作为癌细胞的生物标记物，端粒酶活性的灵敏检测不论是对癌症的诊断还是抗癌药物的筛选都非常重要。
　　本论文在阅读已有文献的基础之上，设计了一系列新型的非标记荧光传感器用于铅离子、汞离子和端粒酶的检测。具体的工作内容如下:
　　第2章中，分别使用钾离子和铅离子作为输入信号，我们构建了一种非标记的抑制型逻辑门用来检测铅离子(Pb2+)。它是基于K+稳定形成的G-四链体向Pb2+稳定形成的G-四链体的构型转换实现的。与K+相比，Pb2+介导形成的G-四链体更稳定，结构上更紧凑，所以，Pb2+可以把K+从G-四链体中置换出来并形成新的G-四链体结构。考虑到K+稳定形成的G-四链体对Pb2+的存在与否很敏感，我们设计了这样的逻辑门用来作为检测Pb2+的传感器，该方法设计简单、操作方便，具有很高的灵敏度和很好的选择性。
　　第3章中，我们设计了一条富G的DNA探针，该探针同样有很多重复的胸腺嘧啶T碱基，由于T-Hg-T组成的双链DNA结构比ThT诱导形成的ThT-G-四链体结构稳定，所以，在存在Hg2+的情况下，Hg2+就可以调控该DNA探针的构型，使G-四链体结构转变为双链DNA结构，这种构型的变化导致ThT的释放，荧光猝灭，也就是说，本实验中Hg2+对ThT诱导形成G-四链体结构具有抑制作用，基于以上机理，我们设计了这种非标记的荧光传感器用于Hg2+的高灵敏检测。该实验方法设计简单、操作方便，具有较高的灵敏度和较好的选择性，并且适用于复杂生物环境中目标物的测定。鉴于该传感器的诸多优点，本方法有望成为饮用水中Hg2+检测的一种很好选择并能应用于复杂环境中的水质分析。
　　第4章中，基于鸟嘌呤可触发DNA为模板合成银纳米簇荧光增强的性质发展了一种高灵敏检测肿瘤细胞中端粒酶活性的分析方法。在该方法中，我们设计了一条包含合成银纳米簇模板的端粒酶扩增引物序列，未存在端粒酶的时候，此模板合成出荧光信号很弱的银纳米簇。在目标端粒酶的作用下，引物进行扩增，扩增出富含G碱基的TTAGGG重复序列，此时合成的银纳米簇不仅使得荧光信号有很大的增强，同时荧光发射波谱红移。这种方法实现了对Hela细胞中端粒酶活性的高灵敏检测，动态响应范围为500到50000个细胞，并且在该范围内荧光信号峰值与HeLa细胞个数的对数呈现良好的线性关系，同时该方法具有较好的选择性，线性范围宽，灵敏度高。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 生物传感器简介

1．1．1 生物传感器的特点

1．1．2 光学生物传感器

1．2 G-四链体探针简介

1．2．1 G-四链体的形成及结构

1．2．2 端粒G-四链体

1．2．3 G-四链体探针用于构建生物传感器

1．3 银纳米簇简介

1．3．1 银纳米簇的性质

1．3．2 银纳米簇在生命医学中的应用

1．4 本研究论文的构想

第2章 基于诱导置换G-四链体中钾离子的逻辑门系统检测铅离子

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂与仪器

2．2．2 目标Pb2+的检测

2．3 结果与讨论

2．3．1 实验原理

2．3．2 实验原理验证

2．3．3 实验条件的优化

2．3．4 传感器对目标物Pb2+的检测性能

2．3．5 复杂样品体系中目标物的检测

2．4 小结

第3章 基于汞离子对生成G-四链体的抑制作用高灵敏检测汞离子

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂与仪器

3．2．2 荧光检测Hg2+

3．3 结果与讨论

3．3．1 传感器的设计原理

3．3．2 实验原理验证

3．3．3 圆二色光谱验证

3．3．4 实验条件优化

3．3．5 Hg2+的检测性能

3．3．6 水样品中Hg2+的检测

3．4 小结

第4章以DNA为模板合成银纳米簇检测肿瘤细胞端粒酶的活性

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂和仪器

4．2．2 细胞的培养

4．2．3 端粒酶的提取

4．2．4 以DNA为模板合成银纳米簇

4．2．5 端粒酶活性的检测

4．2．6 琼脂糖电泳实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 实验设计与工作原理

4．3．2 端粒酶检测的荧光响应

4．3．3 端粒扩增时间的考察

4．3．4 目标端粒酶活性的检测

4．3．5 AZT对端粒酶活性的抑制实验

4．3．6 凝胶电泳分析

4．4 小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢