基于免固定靶标法的C反应蛋白核酸适配体筛选的研究

摘要

C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP)是由肝脏生成的一种急性期蛋白，是炎症及心血管疾病重要的指示因子与危险因子。目前广泛应用的CRP检测方法多是基于抗体辅助的。与抗体相比，核酸适配体不仅具有类似抗体的高亲和力和高特异性，还具有分子量小、易合成和修饰、毒性小、稳定性好等优势。因此，有研究者正尝试筛选CRP的核酸适配体及构建基于核酸适配体的CRP检测传感器，但基于筛选出的CRP核酸适配体实现CRP的检测则鲜有报道。
　　传统的核酸适配体筛选方法多是通过将靶标或文库固定在某种固相基质上进行筛选，并利用固相基质分离结合靶标的链与未结合的链。然而，固定靶标可能会对其构象产生影响，而固定文库则可能会增加空间位阻从而影响靶标与文库的结合。已报道的三条CRP核酸适配体，都是通过将CRP固定在微珠、磁珠及微孔板表面上进行筛选的。但是有研究表明，固定CRP会引起其构象的变化，使得CRP容易转变成单独的亚单元结构;并且其中一条RNA核酸适配体与一条DNA核酸适配体只与CRP的亚单元结合，而不与CRP五聚体结合。因此，有必要利用免固定靶标的筛选方法获取CRP的核酸适配体，以便为相关分析应用提供性能优良的探针。
　　然而，已发展的一些免固定的筛选方法，如膜过滤、毛细管电泳等，仍然存在一些问题。膜过滤法往往会造成较强的非特异性吸附，且只适用于分子量较大的靶标;而毛细管电泳法则需要专门的仪器。由于氧化石墨烯(GrapheneOxide，GO)对单链DNA(ssDNA)有较强的吸附能力，而对双链DNA(dsDNA)或结合了靶标的核酸适配体的吸附能力则较弱，因此GO被用于筛选过程以分离结合靶标的链与未结合的链，进而发展出一种GO辅助的免固定筛选法(GO-SELEX)，克服了膜过滤法及毛细管电泳法所存在的问题。
　　本论文为解决以上的问题及进一步提高筛选出的核酸适配体的亲和力，采用改进的GO-SELEX，以人CRP为靶标开展了核酸适配体的筛选工作，并对筛选出的核酸适配体的性质进行了考察。研究内容包括:
　　(1)改进氧化石墨烯辅助的免固定靶标的筛选方法，并用于CRP核酸适配体的筛选
　　为了避免固定CRP可能造成的构象变化及提高核酸适配体的亲和力，改进了免固定靶标的GO-SELEX筛选方法。首先将文库与GO溶液孵育，通过GO与ssDNA之间的π-π堆积作用将文库吸附在GO上，再加入CRP溶液孵育，与CRP结合较强的DNA链因形成了CRP-DNA复合物而从GO上解吸附下来，而结合较弱或不结合的DNA链仍然吸附在GO上，通过离心收集结合了CRP的DNA链。随着筛选轮数的增加，加入以牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)及肌红蛋白为对照蛋白的反筛选过程，同时文库与CRP的投入比例也逐渐减少。这样的改进使得与CRP结合较弱的DNA链因预先被吸附在GO上而很难形成CRP-DNA复合物，从而提高了筛选出的核酸适配体的亲和力。经过十轮的筛选，对富集度较高的第七轮文库进行了高通量测序，经初步分析后获得20条候选序列。
　　(2)CRP核酸适配体的序列优化及性质考察
　　通过分析比对20条候选序列的二级结构，选取了其中九条序列，利用固定蛋白的表面等离子体共振(Surfaceplasmonresonance，SPR)分析方法对其进行亲和力的考察，获得了四条与CRP亲和力较好的核酸适配体CRP-80-2、CRP-80-5、CRP-80-13和CRP-80-17，其解离常数分别为1.3μM、24.8nM、40.7nM和3.9nM。对其中亲和力最好的CRP-80-17进行序列优化，通过裁掉其两端的固定序列，获得了一条只有40nt的核酸适配体CRP-40-17，并证明其对CRP仍有较高的亲和力。将核酸适配体CRP-80-17和CRP-40-17固定在SPR仪的金膜上，进一步考察了它们对CRP的结合能力。结果表明，固定化的核酸适配体仍然能特异性地结合CRP。此外，初步验证了核酸适配体CRP-40-17与CRP的单克隆抗体具有不同的结合位点。

目录

声明

摘要

本文所用英文缩略诃表

第1章 绪论

1．1 固定靶标的核酸适配体筛选方法

1．1．1 微珠／磁珠固定法

1．1．2 亲和层析柱固定法

1．1．3 金纳米颗粒固定法

1．1．4 微孔板固定法

1．1．5 膜固定法

1．1．6 毛细管固定法

1．1．7 溶胶-凝胶微流控芯片固定法

1．2 固定文库的核酸适配体筛选方法

1．2．1 亲和层析柱固定文库法

1．2．2 微珠固定文库法

1．3 免固定的核酸适配体筛选方法

1．3．1 硝酸纤维素膜分离法

1．3．2 凝胶电泳分离法

1．3．3 离心分离法

1．3．4 毛细管电泳分离法

1．3．5 氧化石墨烯分离法

1．4 测序结果的分析与核酸适配体序列的优化

1．4．1 测序结果的分析

1．4．2 核酸适配体序列的优化

1．5 本文拟开展的工作

第2章 改进的氧化石墨烯辅助的免固定靶标法用于C反应蛋白核酸适配体的筛选

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂和仪器

2．2．2 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定文库及引物质量

2．2．3 文库与氧化石墨烯吸附比例的优化

2．2．4 C反应蛋白核酸适配体的筛选过程

2．2．5 高通量测序及结果分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 筛选流程

2．3．2 文库及引物质量鉴定

2．3．3 氧化石墨烯与预处理文库吸附比例的测定

2．3．4 PCR条件的优化

2．3．5 筛选文库富集度的考察

2．3．6 高通量测序结果的分析

2．4 小结

第3章 C反应蛋白核酸适配体的序列优化及性质考察

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂和仪器

3．2．2 测序结果的二级结构分析

3．2．3 筛选序列亲和力的测定

3．2．4 核酸适配体序列的优化

3．2．5 固定化的核酸适配体对C反应蛋白结合能力的考察

3．2．6 筛选序列特异性的测定

3．2．7 CRP核酸适配体与其抗体识别位点差异的初步考察

3．3 结果与讨论

3．3．1 二级结构的分析

3．3．2 序列亲和力的测量结果

3．3．3 序列优化的结果

3．3．4 固定化的核酸适配体对C反应蛋白结合能力的测定结果

3．3．5 序列特异性的测量结果

3．3．6 CRP核酸适配体与其抗体识别位点差异的初步考察结果

3．4 小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢