免标记核酸适体探针用于肿瘤细胞的激活式检测研究

摘要

核酸适体(aptamer)因具有亲和力高、特异性强、易合成和修饰、化学稳定性好等优点，被称之为化学家的“抗体”在肿瘤诊断领域受到了广泛关注。目前基于aptamer的肿瘤细胞检测技术主要依赖于“alwayson”分析策略，往往存在背景信号高、灵敏度不足且需借助洗脱程序而操作复杂等缺点。与之相比，激活式分析策略在改善灵敏度和简化实验操作等方面更具优势。然而现阶段激活式aptamer探针的发展尚处于起步阶段，尤其是开发免标记激活式探针用于肿瘤细胞检测研究仍然十分必要。基于此，本论文即瞄准这一前沿研究方向，选择CCRF-CEM人白血病细胞为研究对象，构建了两种新型的免标记激活式aptamer探针并开展了相关肿瘤细胞检测研究。具体包括以下工作:
　　1、基于识别触发裂开型DNAzyme催化活性的免标记核酸适体探针用于肿瘤细胞激活式检测研究
　　利用裂开型DNAzyme催化活性可控以及aptamer序列设计灵活且构型变化多样的优势，通过PEGlinker将肿瘤特异性aptamer与G四链体分裂体整合为一条序列，构建了一种新型的带尾发夹型激活式aptamer探针(THAAP)。该探针在游离状态时主要为发夹构型，G四链体形成得到抑制而无法与hemin结合并发挥催化活性;而当体系中引入靶肿瘤细胞后，细胞膜表面的特异性受体可有效结合aptamer同时触发THAAP发生构型转换而释放游离G四链体分裂体序列。该序列即可与hemin结合并形成具有过氧化物酶活性的复合体，进而实现靶肿瘤细胞的比色检测。以CCRF-CEM细胞的特异性aptamerSgc8c为模型，采用酶标仪采集信号，通过对包括缓冲液组分和pH、hemin和底物浓度等在内的催化显色体系以及THAAP探针序列进行优化，成功构建了一种可用于CCRF-CEM细胞特异性检测的免标记激活式aptamer探针。该探针在最优条件下可有效实现0～26，700个细胞范围内CCRF-CEM细胞的定量检测，且最低可检测3，300个细胞。鉴于aptamer种类的不断增加，该策略将有望发展成为一种通用的简单、方便、快速、特异且免标记的肿瘤细胞激活式检测技术。
　　2、基于细胞内荧光增强效应的DNA稳定银纳米簇-核酸适体探针用于肿瘤细胞激活式检测研究
　　利用邻近富G序列可有效诱导DNA稳定银纳米簇(AgNCs)荧光增强的性质以及细胞核内富含G重复端粒序列的特点，构建了一种新型的具有细胞内荧光增强效应的AgNCs。采用流式细胞术，以固定化肿瘤细胞为模型，系统考察了该AgNCs细胞内荧光激活性能的影响因素，包括作用时间、作用浓度、DNA模板序列等。结果表明，AgNCs的细胞内荧光增强效果具有明显的时间和浓度依赖性，随作用时间的延长和浓度的增加，肿瘤细胞荧光信号也逐渐增强。同时，在AgNCs合成DNA模板端部延长一段随机序列也会对其荧光增强效应起到明显的促进作用，且随延长序列长度的增加表现出先增强后减弱的规律。激光共聚焦成像结果则显示，AgNCs在细胞内的荧光激活位点主要集中在细胞核区域。在此基础上，进一步结合Sgc8c对CCRF-CEM细胞的特异性识别能力，以该AgNCs为激活式信号输出元件，分别采用一段式整合和两段式杂交设计，构建了两种AgNCs-Sgc8c探针，并成功实现了靶细胞的特异性激活式检测。这为发展一种简单、快速、灵敏、特异且免标记的激活式肿瘤细胞荧光检测新方法奠定了基础。

目录

声明

摘要

本文常用英文缩略词表

第1章 绪论

1．1 肿瘤细胞检测的重要性及常规方法

1．1．1 肿瘤细胞检测的重要性

1．1．2 肿瘤细胞检测的常规方法

1．2 核酸适体的概念和特点

1．3 核酸适体探针在肿瘤细胞检测中的应用

1．3．1 “always on”检测策略

1．3．2 激活式检测策略

1．4 本文拟开展的工作

第2章 基于识别触发裂开型DNAzyme催化活性的免标记核酸适体探针用于肿瘤细胞激活式检测研究

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂和仪器

2．2．2 肿瘤细胞的培养与传代

2．2．3 Split G-quadruplex的催化作用条件优化

2．2．4 HEPES buffer中aptamer对靶标细胞的识别效果考察

2．2．5 THAAP的构建及用于CCRF-CEM细胞特异性检测的可行性考察

2．2．6 THAAP检测CCRF-CEM细胞的条件优化

2．2．7 THAAP对CCRF-CEM细胞的定量检测考察

2．3 结果与讨论

2．3．1 实验原理

2．3．2 Split G-quadruplex的催化作用条件优化

2．3．3 HEPES buffer中aptamer对靶标细胞的识别效果考察

2．3．4 THAAP的构建及其用于CCRF-CEM细胞特异性检测的可行性

2．3．5 THAAP检测CCRF-CEM细胞的条件优化

2．3．6 THAAP对CCRF-CEM细胞的定量检测考察

2．4 小结

第3章 基于细胞内荧光增强效应的DNA稳定银纳米簇-核酸适体探针用于肿瘤细胞激活式检测研究

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂和仪器

3．2．2 肿瘤细胞的培养与传代

3．2．3 细胞的固定

3．2．4 Ag NCs的制备和表征

3．2．5 流式细胞仪分析Ag NCs的胞内荧光激活可行性和性能优化

3．2．6 激光共聚焦实验考察Ag NCs在细胞内的荧光激活位点

3．2．7 Ag NCs-aptamer用于CCRF-CEM细胞的特异性检测

3．3 结果与讨论

3．3．1 Buffer中Ag NCs的荧光增强效应考察

3．3．2 Ag NCs的细胞内荧光激活性能考察

3．3．3 Ag NCs的细胞内荧光激活性能优化

3．3．4 Ag NCs的细胞内荧光激活位点考察

3．3．5 Ag NCs-aptamer探针的构建及用于CCRF-CEM细胞特异性分析的可行性

3．4 小结

结论

参考文献

致谢

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