水稻内生放线菌OsiLf-2的分离、鉴定及其抗稻瘟病研究

摘要

稻瘟病(Rice Blast)是由真菌梨孢霉（Magnaporthe grisea）引起的一种严重的水稻疾病，是近几十年来制约水稻高产稳产的最主要因素之一。目前其防治手段主要依赖于化学农药和抗性育种，但化学农药所带来的环境危害及新的致病生理小种的不断出现，使我们迫切需要寻找一种绿色、可持续的的稻瘟病防治手段。植物内生放线菌不需与土壤微生物竞争，并可以通过直接杀死病原菌或通过促进寄主植物的生长和诱发免疫反应来间接提高植物抗病性，已作为一种新型的抗稻瘟病资源受到关注。本文从不同病斑生成状况的水稻叶片中分离并筛选出一株能够明显抑制稻瘟病菌生长的内生放线菌OsiLf-2，对其拮抗性能、培养条件和活性物质开展了研究，为进一步深入了解该内生放线菌抗病机制及其农业开发利用提供依据。主要的研究内容和结果如下:
　　1、采用不同的分离培养基，分离不同病斑生成状况的水稻叶片中的内生放线菌。利用平板对峙法对所分离出的内生放线菌进行筛选，最后得到一株对稻瘟病病原菌有明显拮抗效果的内生放线菌OsiLf-2。该菌对不同生理小种的稻瘟病菌均表现出较好的抑制效果，其中对稻瘟病菌Guy11的抑制率达83.0％，结合形态特征、培养特征、生理生化特征及16S rRNA序列分析鉴定其为产水链霉菌(Streptomyces hydrogenans)。
　　2，利用扫描电子显微镜观察OsiLf-2对稻瘟病菌菌丝的影响，结果显示经OsiLf-2处理后的稻瘟病菌RB3菌丝呈现了明显的畸形和扭曲。进一步探究不同培养条件下OsiLf-2的生长状况及其发酵液的拮抗性能，发现其能在多种培养基下生长，尤其在营养丰富的培养基如ISP2和PDB中生长状况好，且其发酵液的拮抗能力也突出，第5天发酵液对稻瘟病菌RB3菌丝抑制率分别达到63.3％和68.4％。同时，培养初始pH为7，培养温度35℃分别对OsiLf-2的生长最为有利，其发酵液的抑菌活性也最强。除此之外，OsiLf-2发酵液也表现出良好的稳定性，用蛋白酶K、低温、强光照和紫外光照分别处理一个小时，其发酵液均能保持完整的抑菌活性;强酸和强碱分别处理一个小时，也能保持较好的抑菌活性;甚至在100℃处理一个小时后，其发酵液仍然保留了大部分的抑菌活性。
　　3、对OsiLf-2产生的拮抗稻瘟病相关物质进行检测，发现OsiLf-2能够产生蛋白酶、铁载体等抑菌物质。用不同极性的萃取剂对其拮抗物质进行萃取，发现OsiLf-2菌体和培养物的乙酸乙酯及石油醚萃取物显示出良好的抑菌活性，且石油醚萃取物的抑菌活性最强。对OsiLf-2产生的促生长相关物质进行检测，发现OsiLf-2能够分泌铁载体、合成IAA和ACC脱氨酶等促生长物质，采用培养了OsiLf-27天后的PDA培养基，探究其对水稻生长的影响，发现，处理后的水稻幼苗株高和根长、地上部和根部分干物质量及叶绿素含量(SPAD值)较对照分别增加10％、34％、48％、10％和16％，表明OsiLf-2的代谢产物中含有对水稻起促生作用的成分。
　　综上表明，内生放线菌OsiLf-2对稻瘟病菌有较好的抑制效果，对水稻幼苗有一定的促生效果，而且其分离自水稻内部，不会对水稻及周围环境造成二次污染，在水稻稻瘟病的生物防治和新型农药开发方面有很大的应用潜力。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 水稻病害及其防治

1．1．1 水稻病害概述

1．1．2 水稻稻瘟病及其特征

1．1．3 稻瘟病的传统防治手段

1．2 植物病害生物防治的研究概况

1．2．1 植物病害生物防治的分类

1．2．2 植物病害生物防治的应用现状

1．3．1 植物内生菌概述

1．3．2 植物内生菌生防机制

1．4 水稻内生放线菌的水稻病害防治

1．4．1 放线菌

1．4．2 水稻内生放线菌在水稻病害防治中的应用

1．5 论文选题背景、研究内容与思路

1．5．1 论文选题背景

1．5．2 论文研究内容与思路

第二章 水稻内生放线菌的分离及稻瘟病拮抗菌的筛选鉴定

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．2．3 实验试剂及培养基

2．2．4 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 水稻内生放线菌的分离

2．3．2 抗稻瘟病菌水稻内生放线菌的筛选

2．3．3 拮抗菌OsiLf-2的形态、培养以及生理生化特征

2．3．4 OsiLf-2的16S rRNA序列及系统发育分析

2．4 本章小结

第三章 OsiLf-2抗稻瘟病菌能力的分析

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．2．3 实验试剂及培养基

3．2．4 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 OsiLf-2对稻瘟病菌RB3的影响

3．3．2 不同培养条件对OsiLf-2生长及拮抗性能的影响

3．3．3 OsiLf-2发酵液稳定性

3．4 本章小结

第四章 OsiLf-2活性物质检测分析及其对水稻生长影响的初步研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验仪器

4．2．3 实验试剂及培养基

4．2．4 实验方法

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 OsiLf-2菌株产生的抑菌活性物质

4．3．2 OsiLf-2抑菌物质初步分离

4．3．3 OsiLf-2产生的植物促生活性物质

4．3．4 OsiLf-2培养物对水稻幼苗生长的影响

4．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的论文和专利

附录

致谢