碱性磷酸酶和朊蛋白新型电化学生物传感器研究

摘要

碱性磷酸酶（AP)是一类底物特异性较低，能在碱性条件下将磷酸基团水解的酶，碱性磷酸酶存在于许多活性组织的细胞中，也存在于细胞之外的许多生物质中，其活性与人体健康息息相关。目前，碱性磷酸酶的含量异常已被证明与乳腺癌、前列腺癌、肝功能障碍、骨骼疾病和糖尿病等许多疾病有关，其生理功能对于人体有着重要意义，因此实现碱性磷酸酶活性的灵敏检测非常必要。
　　朊蛋白(PrP)是可传播性海绵状脑病(TSE)的致病介导因子，因此 TSE又被称之为朊蛋白病毒性疾病(Prion diseases)。朊蛋白病毒性疾病具有高度传播性，可致人类和动物的神经元及生物组织变性，最终导致生物体认知和运动功能的严重退行，直至生物体死亡。朊蛋白病毒性疾病的早期诊断与致病因子朊蛋白的检测息息相关，实现朊蛋白的灵敏检测已经刻不容缓。
　　电化学生物传感器是一类以电化学技术为转换器件且对生物敏感元件有特异性识别作用的一种传感器。传感器与作为敏感元件的具有识别作用的生物成分结合，然后与电化学转换器联用，对特定分析物能产生可识别的电化学信号，电化学生物传感器因其灵敏度高、选择性好、成本低、分析速度快等优势，近年来获得了迅速的发展。
　　利用电化学生物传感器所具有的优点，本文开展了对电化学DNA传感器和电化学免疫传感器的研究，用于 AP和 PrP的高灵敏性高选择性检测：
　　(1)利用末端转移酶(TdT)引入大量血晶素/G四联体 DNA酶，发展一种基于 DN A的电化学生物传感器，应用于 AP活性的检测。由3’端修饰巯基的DNA1与3’端修饰磷酸基团的DNA2杂交组成的双链DNA(dsDNA)探针通过金硫键(Au-S)固定在金纳米粒子(AuNPs)修饰的玻碳(GC)电极表面上。经 AP作用后， DN A2的3’端去磷酸化变为羟基末端。Td T酶可识别3’羟基末端并催化脱氧胸苷三磷酸(d TTPs)聚合，使其在 DN A2的3’羟基端扩增得到一个聚 T碱基序列。然后富 G碱基的 DN A3与聚 T碱基序列杂交。在加入血晶素后，血晶素/G四联体 DNA酶形成。血晶素/G四联体 DNA酶将 N ADH氧化为 N AD+同时伴有 H2O2生成。随后 H2O2进一步被作为仿辣根过氧化物酶的血晶素/G四联体 DN A酶纳米线催化，此过程中硫堇(Thi)作为电子中间体，导致电化学信号放大。制备的电化学 DN A传感器对 AP的检测表现出良好的选择性，重现性和稳定性，线性范围从0.1 U L-1到5 U L-1，检测限为0.03U L-1。
　　(2)在电化学免疫传感的基础上引入杂交链式反应(HCR)技术，发展了一种细胞型朊蛋白(PrPC)的灵敏检测方法。首先将朊蛋白一抗(Ab1)固定于金纳米粒子(AuNPs)修饰的玻碳(GC)电极上，当抗原 PrPC存在时，PrPC与 Ab1识别发生免疫反应。随后在体系中加入标记了一段部分互补的 dsDN A（含两个HCR引发 DNA序列）的 PrPC二抗(Ab2)，Ab2与 PrPC免疫反应后，再加入4个发卡DNA(HP1, HP2, HP3, HP4)和电化学活性物质[Ru(NH3)6]Cl3，Ab2上标记的含两个引发DNA序列的dsDNA可以引起HP1, HP2和HP3, HP4发生HCR过程，形成的双股长 dsDNA结构可吸附大量的[Ru(NH3)6]Cl3产生电化学响应，实现 PrPC的灵敏检测。此电化学免疫传感器结合了 HC R这一先进的DNA纳米组装技术，具有良好的选择性、重现性和稳定性。在0.5 pM到2.5 pM范围内成线性关系，检测限达0.26 pM。
　　(3)研究了一种基于氧化石墨烯/硫堇(GO/Thi)复合物和适配体(Aptamer, Apt)的电化学免疫传感器，实现了 PrPC的灵敏检测。首先将 Ab1金纳米粒子(AuNPs)修饰在玻碳(GC)电极上，当抗原 PrPC存在时，PrPC与 Ab1识别发生免疫反应。随后，PrPC适配体(Apt)加入并与电极上的 PrPC发生亲和识别。最后，在电极界面引入制备好的 GO/Thi复合物，通过π-π堆积作用， GO/Thi复合物和顶端 Apt结合，产生相应的电化学响应，以此实现 P rP C的灵敏检测。此新型电化学免疫传感器可以灵敏且选择性地检测 PrPC，具有良好的重现性和稳定性。线性范围从0.5 pM到2pM，检测限达0.12 pM。

目录

声明

第1章 绪论

1.1碱性磷酸酶

1.2 朊蛋白

1.3电化学生物传感

1.4 本课题选择的内容与意义

第2章 基于TdT酶辅助血晶素/G四联体DNA酶纳米线的碱性磷酸酶活性电化学生物传感器研究

2.1前言

2.2实验部分

2.3结果与讨论

2.4本章小结

第3章 基于HC R的朊蛋白电化学免疫传感器研究

3.1前言

3.2实验部分

3.3结果与讨论

3.4 本章小结

第4章 基于硫堇-石墨烯复合物及适配体的朊蛋白电化学免疫传感器研究

4.1 前言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

结论

参考文献

附录A攻读学位期间所发表的学术论文

致谢