小单孢菌40027菌株质粒pJTU112中复制区和接合转移区的定位和分析

摘要

小单孢菌(Micromonospora)是一类能产生多种抗生素的稀有放线菌。近年来,随着海洋资源开发的不断深入,海洋微生物新药的发现逐年增多,海洋小单孢菌产生的抗生素具有独特的结构和生物活性,已引起世界各国的重视。然而,关于小单孢菌的遗传操作体系,尤其在基因克隆系统方面的研究甚少。质粒pJTU112是从小单孢菌40027菌株中分离得到的具有自主复制、整合和接合转移功能的质粒。本研究对质粒pJTU112进行序列测定,在此基础上,对复制区和接合转移区进行研究。
　　对质粒pJTU112的全序列进行测定和分析,质粒pJTU112全长13,648bp,G+C含量为74.6％,包含13个ORF,序列分析结果表明,pJTU112.3、pJTU112.4和pJTU112.5与质粒复制功能相关;pJTU112.1、pJTU112.2、pJTU112.12和pJTU112.13与质粒接合转移功能相关;pJTU112.6与质粒pJTU112的位点特异性重组相关;pJTU112.9可能与质粒的抗生素抗性相关。
　　利用pHZ199、pOJ260等载体构建了一系列质粒pJTU112的衍生质粒,转入消除质粒的小单孢菌LXH20菌株,包含1.4kbBamHIDNA片段的质粒(如:pJTU111,pJTU116和pSCU207)获得硫链丝菌素或阿泊拉霉素抗性接合转移子,并从接合转移子中分离到相应质粒。而不含1.4kbBamHIDNA片段的质粒,未获得相应抗性接合转移子。表明1.4kbBamHIDNA片段为质粒pJTU112复制必需区。质粒pSCU207包含来自于质粒pJTU112的4.7kbSacI-KpnIDNA片段,在小单孢菌LXH20菌株中具有自主复制功能,表明质粒pJTU112复制区初步定位在约4.7kb的SacI-KpnIDNA片段上。
　　对pJTU112.5编码蛋白的氨基酸序列进行比对分析,发现pJTU112.5与链霉菌(S.ghanaensis)质粒pSG5中的复制蛋白Rep具有57%的同源性,pJTU112.5上游含有正向重复序列和反向重复序列,与质粒pMEA300、pMEA100、pSG5和pSE211的nick位点比较发现,质粒pJTU112在1647bp处存在一个类似的nick位点。
　　利用pHZ199构建了质粒pJTU112的衍生质粒pSCU213、pSCU214和pSCU215等,通过大肠杆菌与小单孢菌间的接合转移,将重组质粒转入小单孢菌LXH20菌株中,再通过小单孢菌间的接合转移,验证质粒的接合转移功能。
　　对pJTU112.1、pJTU112.2和pJTU112.12编码的蛋白比对分析,发现pJTU112.1(302aa)与红球菌细胞分裂蛋白FtsK有32%的同源性;pJTU112.2(478aa)与小单孢菌细胞分裂蛋白FtsK/SpolIIE具有69%的同源性,并且pJTU112.2中包含保守的FtsK/SpolIIE结构域,同时pJTU112.2中含有一个保守的氨基酸序列(RAAGI)和一个保守的核酸结合位点GAGKS;pJTU112.12(785aa)与链霉菌(S.avermitilis)MA-4680中主要的质粒转移蛋白有38%的同源性,含有Ftsk_gamma结构域。

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第1章 绪 论

1.1放线菌中具有整合和接合转移功能质粒的简介

1.2具有整合和接合转移功能质粒的复制研究进展

1.3具有整合和接合转移功能质粒的接合转移研究进展

1.4小单孢菌简介

1.5 小单孢菌质粒简介

1.6 本研究的目的和意义

第2章 材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

第3章 小单孢菌40027菌株质粒pJTU112的序列测定和分析

3.1 质粒pJTU112序列测定

3.2 质粒pJTU112序列的生物信息学分析

3.3 小结

第4章 小单孢菌40027菌株质粒pJTU112复制区的定位及分析

4.1质粒pJTU112衍生质粒的构建

4.2 质粒pJTU112复制区的定位

4.3重组质粒在小单孢菌中的稳定性分析

4.4 质粒pJTU112复制方式的分析

4.5 小结

第5章 小单孢菌40027菌株质粒pJTU112接合转移区的定位及分析

5.1质粒pJTU112接合转移功能的鉴定

5.2质粒pJTU112接合转移蛋白的比对分析

5.3质粒pJTU112接合转移区重组质粒的构建

5.4重组质粒接合转移功能的验证

5.5 小结

第6章 总结与展望

6.1总结

6.2展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文