水稻HL-CMS育性恢复基因Rf6的初步研究

摘要

水稻红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)的育性恢复受Rf5和Rf6共同控制。Rf5定位于第10号染色体，编码的蛋白RF5能与GRP162形成复合物，识别并催化atp6-orfH79转录本剪切。但Rf6定位于水稻8号染色体上，功能不十分清楚，本研究对Rf6的研究，取得了如下结果：
　　1、根据Rf6定位信息，克隆了预测的具有PPR结构域的Rf6及rf6基因。根据Rf6和rf6序列差异性开发了区分两个基因的分子标记。含Rf6基因的材料能扩增出750 bp左右的特异条带，而含有rf6基因的材料可扩增出400 bp左右的特异条带，这一分子标记可用于恢复系的辅助选择。
　　2、构建了Rf6的植物超表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化YTB和YTA，通过PCR鉴定，分别获得了Rf6转YTB的阳性植株11株和转YTA阳性植株5株。
　　3、构建了Rf6开放阅读框的原核表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)中。20℃，0.3 mmol/L IPTG诱导4 h条件下，能收获较大量可溶性蛋白，经Glutathione Resin亲和层析系统获得了纯化的RF6蛋白。

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第一章 文献综述

1.1 水稻细胞质雄性不育

1.1.1 水稻细胞质雄性不育的分类

1.1.2 水稻细胞质雄性不育的基因

1.2 水稻细胞质雄性不育性恢复基因

1.2.1 已克隆的水稻CMS育性恢复基因

1.2.2 水稻CMS育性恢复基因的作用机制

1.3实验研究的内容及意义

第二章 水稻育性恢复基因Rf6分子标记的开发

2.1材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验设备

2.1.3实验试剂

2.1.4 PCR引物

2.2实验方法

2.2.1感受态细胞的制备

2.2.2 Rf6基因的PCR扩增与纯化

2.2.3 Rf6基因的克隆

2.2.4 遗传标记Rf6 JD

2.3 结果分析

2.3.1 PCR产物纯化后检测

2.3.2 TA-Rf6克隆载体的构建

2.3.2 开发特异遗传标记Rf6 JD

2.4结果讨论

第三章 水稻育性恢复基因Rf6表达载体构建及遗传转化

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验设备

3.1.3实验试剂

3.2实验方法

3.2.1感受态细胞的制备

3.2.2 pCAMBIA1302∷35S∷Rf6 植物表达载体的构建

3.2.3 pCAMBIA1302∷35S∷Rf6 植物表达载体的遗传转化

3.2.4 转基因苗植株鉴定

3.2.5 水稻花粉育性检测

3.3 结果分析

3.3.1 pCAMBIA1302::35S::Rf6载体构建

3.3.2 pCAMBIA1302∷35S∷Rf6表达载体的遗传转化

3.3.3 转基因植株阳性鉴定

3.3.4 转基因植株花粉育性鉴定

3.4 讨论

第四章 育性恢复基因Rf6的原核表达及蛋白纯化

4.1 材料与方法

4.1.1研究对象

4.1.2主要仪器

4.1.3 主要试剂

4.2 实验方法

4.2.1 原核表达中间载体的构建

4.2.2 重组融合蛋白的表达

4.2.3 重组蛋白的Western Blot 检测

4.2.4 纯化蛋白检测

4.3 结果分析

4.3.1 原核表达中间载体的构建

4.3.2 原核表达载体的构建

4.3.3 原核表达载体诱导表达条件的优化

4.3.4 Western Blot 检测目的蛋白

4.3.5 蛋白纯化检测

4.4 小结与讨论

参考文献

致谢