一种老年痴呆蛋白疫苗制备工艺的研究

摘要

老年性痴呆已经成为全球的―流行病‖之一，是影响老年健康的第四杀手。在老年性痴呆症中最常见的是阿尔茨海默病。阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病，是发生在老年期以及老年前期的原发性脑病，其主要表现为中枢神经持续性功能活动障碍。目前，研究者普遍认为，大脑组织中β-淀粉样蛋白的过度沉积是导致神经元损伤及认知功能障碍的主要原因，因此，以刺激机体产生Aβ特异性抗体从而清除大脑内Aβ1-42沉积为目的的Aβ主动免疫疫苗，是治疗预防阿尔茨海默病的重要方法。
　　诺如病毒 P颗粒，具有三个环状结构，非常适合于外源表位的插入；此外，诺如病毒P颗粒能够在体外自主装形成24聚体形式，是非常好的抗原展示平台。本研究中选择Aβ1-6作为表位，诺如病毒P颗粒为载体，将3拷贝的Aβ1-6基因分别插入到诺如病毒 P颗粒蛋白载体的3个环状结构域上，通过基因重组技术得到质粒pET26b-PP-3copy-Aβ1-6-loop123。将质粒转入大肠杆菌BL21中，分别在小试和发酵罐水平对蛋白进行诱导表达，并对表达条件进行优化以提高蛋白产量。确认最优蛋白表达诱导条件为：在小试中诱导剂IPTG浓度0.5 mmol/L，16℃诱导12 h；在发酵罐中最适宜发酵时间为11 h。诱导条件优化后，蛋白的表达量有明显提升，其中，可溶性表达蛋白的表达量从小试的1.5 mg/L增加到中试的8 mg/L；包涵体表达蛋白的表达量由小试的60 mg/L增加到中试的300 mg/L。
　　同时，研究采用SuperdexTM200、透射电镜以及粒径仪对目的蛋白的多聚体形式和颗粒大小进行鉴定，结果表明，目的蛋白以24聚体，12聚体以及2聚体三种多聚体形式存在，可溶性表达中24聚体所占比例较大，蛋白颗粒大小为24 nm左右，而包涵体复性蛋白中12聚体所占比例较大，蛋白颗粒大小约为16 nm。
　　最后，通过小鼠免疫检测该蛋白疫苗的免疫原性和安全性。结果显示重组蛋白疫苗具有很好的免疫原性，能够在体内诱导产生高浓度Aβ1-42特异性抗体，且不会引起 T细胞免疫反应，免疫动物不会出现脑膜炎症状，具有良好的安全性。本研究为PP-3copy-Aβ1-6-loop123蛋白疫苗实现工业化生产奠定了一定的实验基础。

目录

声明

英文缩略词表

第1章 绪 论

1.1 阿尔茨海默病的简介

1.1.1 阿尔茨海默病

1.1.2 阿尔茨海默病患者分布与趋势

1.1.3 阿尔茨海默病的发病机理

1.1.4 Aβ免疫治疗研究

1.2 诺如病毒P颗粒疫苗载体的研究

1.2.1 诺如病毒

1.2.2 诺如病毒P颗粒疫苗载体的应用

1.3 本课题的研究意义与实验设计

1.3.1 本课题的意义

1.3.2 实验设计

第2章 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要仪器

2.1.3 试剂配制

2.2 主要实验方法

2.2.1 转化实验

2.2.2 菌种筛选

2.2.3 蛋白表达

2.2.4 SDS-PAGE检测方法

2.2.5 Native-PAGE检测方法

2.2.6 Western Blot检测方法

2.2.7 蛋白纯化-镍柱亲和层析

2.2.8 包涵体纯化与复性

2.2.9 BCA试剂盒定量蛋白浓度

2.2.10 凝胶层析色谱分析

2.2.11 蛋白颗粒大小以及形态鉴定

2.2.12 小鼠免疫实验

2.2.13 ELISA检测

2.2.14 ELISPOT检测

第3章 实验结果

3.1 质粒构建

3.1.1 质粒构建示意图

3.1.2 质粒构建图谱

3.1.3 质粒测序结果

3.1.4 质粒试表达

3.1.5 小结

3.2 菌种筛选以及诱导条件优化

3.2.1 菌种筛选

3.2.2 蛋白表达诱导条件优化

3.2.3 发酵罐试表达蛋白

3.2.4 小结

3.3 蛋白表达与纯化

3.3.1 蛋白表达

3.3.2 可溶性蛋白纯化

3.3.3 包涵体蛋白纯化

3.3.4 蛋白浓度测定

3.3.5 小结

3.4 蛋白物理性质检测

3.4.1 多聚形式检测

3.4.2 蛋白颗粒大小检测

3.4.3 小结

3.5 蛋白生物活性检测

3.5.1 蛋白免疫原性检测

3.5.2 免疫蛋白安全性检测

3.5.3 小结

第4章 讨 论

第5章 结 论

致谢

参考文献

作者简介

攻读硕士学位期间研究成果