钙磷降解材料生物矿化的细胞分子生物学基础研究

摘要

生物医用材料是材料科学技术的一个分支，相关研究涉及生物医学领域中最基本的科学问题。为了探讨无生命的物质参与构建有生命组织的机制，开展了钙磷降解材料生物矿化的细胞分子生物学基础研究。 设计并建立了细胞培养→基因克隆→基因表达→蛋白质纯化→蛋白质分子与材料作用的系统研究模式。首先采用酶消化法和植块法从Wistar乳鼠颅骨体外分离培养了大鼠成骨细胞，两种方法获得的成骨细胞经传代培养和纯化后，显示出高的碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力，具有良好的生物学特性。将原代培养后传至第3代、经过纯化、状态良好的成骨细胞进行冻存，复苏后存活率达93％，碱性磷酸酶染色呈强阳性，有钙结节形成，可扩增碱性磷酸酶基因，与未冻存细胞比较，复苏细胞的生物学特性无明显改变； 设计了一对PCR反应特异性引物F1、R1，从酶消化法分离培养的Wistar乳鼠成骨细胞总RNA中扩增出骨粘连蛋白的编码区cDNA序列，将PCR产物插入pBS-T载体，测序并与GenBank核酸数据库比对，其序列与GenBank核酸数据库中收录的一致； 将大鼠骨粘连蛋白基因重组到原核表达载体pGEX-KG中，构建了正确的表达载体pGEX-KG/ON，在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysS中实现了全长表达，表达的融合蛋白存在于细菌裂解液上清中，上清中的目的蛋白采用硫酸铵分级沉淀、超滤膜分离、GST亲和层析逐步纯化，获得了高纯度的大鼠骨粘连蛋白； 将大鼠成骨细胞与钙磷材料混合培养，显微镜下可观察到成骨细胞对钙磷材料有明显的吞噬作用；细胞计数、MTT和CKK-8等实验结果表明，钙磷材料有利于成骨细胞增殖； 将骨粘连蛋白与Ca2+离子作用，采用等离子体发射光谱仪进行检测，证明所获得的骨粘连蛋白可结合钙离子；骨粘连蛋白与钙磷材料作用后，SEM、XRD、XPS测试结果显示，蛋白在钙磷材料表面发生了吸附和键合反应。骨粘连蛋白通过Ca2+离子结合位点结合Ca2+，通过-NH3+结合PO43-，并启动羟基磷灰石晶核形成，以高的亲和力吸附羟基磷灰石晶核后，从材料表面解吸，通过胶原结合位点在胶原纤维上吸附，实现其结合钙/磷、转运钙/磷、结合胶原蛋白的功能，引导钙盐在基质中沉积和骨的矿化。

目录

文摘

英文文摘

第1章绪论

第2章生物可降解钙磷材料的制备

第3章大鼠成骨细胞的分离、培养及冻存

第4章大鼠骨粘连蛋白基因克隆及序列分析

第5章大鼠骨粘连蛋白基因在原核中的表达及骨粘连蛋白的纯化

第6章钙磷材料与成骨细胞及骨粘连蛋白的相互作用

第7章结论

参考文献

附录攻读博士学位期间发表的论文

致谢