类贝壳珍珠层蛋白重组设计及其对碳酸钙矿化的研究

摘要

贝壳珍珠层作为一种典型的生物矿物而备受关注，它是一种天然的有机无机层状复合材料，独特的多尺度组装结构赋予其优异的机械性能。珍珠层中无机相约占总重量的95％，其余的为有机相主要由三种生物大分子组成：不可溶的多糖几丁质、类似蚕丝蛋白结构的蛋白、富含天冬氨酸等酸性氨基酸的可溶蛋白。贝壳珍珠层的形成与碳酸钙结晶过程中的有机物大分子密切相关，因此研究与矿化相关有机物的作用对于理解整个矿化过程是非常重要的。
　　本文从贝壳珍珠层有机质的组成角度出发，合成一个类似珍珠层有机质组成的重组蛋白，通过该蛋白指导碳酸钙矿化进而理解珍珠层的矿化机制。该蛋白命名为CCaS，CCaS是由几丁质结合区域(chitin domain-C)、钙离子结合区域(calcium ion binding region-Ca)、蚕丝蛋白重复序列(silk protein repeat
　　segments-S)三段组成，其中几丁质结合区域来源于载体质粒PTWIN1上的几丁质结合区域（chitin binding domain-CBD）。通过酶切、连接反应将设计基因片段插入到PTWIN1上的CBD序列后面，表达获得重组蛋白CCaS并且在低温下进行纯化，用盐酸胍洗脱重组蛋白，再通过梯度透析使蛋白复性。最后通过吸附实验和钙离子结合实验验证重组蛋白是否复性。
　　将几丁质树脂与适量蛋白溶液混合均匀，4℃过夜结合，然后将吸附有蛋白的几丁质加入到矿化溶液中，在实验设计温度下静置。本实验研究了不同矿化时间、矿化温度、矿化起始pH对矿化结果的影响。发现随着矿化溶液中蛋白含量的提高球文石出现在几丁质表面，且溶液中蛋白含量越高晶体形貌越趋近于球形，低温pH8.5条件下更有利于蛋白质发挥作用。

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第1章 绪 论

1.1仿生学与生物矿化

1.2生物矿化中的结晶理论

1.3贝壳结构

1.4矿化相关有机质大分子

1.5贝壳珍珠层结构仿生的研究现状

1.6贝壳珍珠层矿化模型

1.7课题研究内容和意义

第2章 材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3测试和表征

第3章 类珍珠层蛋白重组构建

3.1设计蛋白CCaS基因序列

3.2载体质粒的构建

3.3重组蛋白的表达

3.4重组蛋白的纯化

3.5重组蛋白的透析

3.6小结

第4章 重组蛋白活性检测

4.1几丁质结合区域的功能验证

4.2钙结合区域的功能验证

4.3小结

第5章 重组蛋白对碳酸钙的矿化作用

5.1实验部分

5.2重组蛋白作用下碳酸钙颗粒的形成机制

5.3结果与讨论

第6章 总结与展望

致谢

参考文献