介孔Fe3O4基纳米输送体系的构建及其在外磁场作用下促成骨效应研究

摘要

骨结核是最常见的肺外结核，其发病率较高。针对骨结核的难治性和耐药性，以及病灶清除后骨缺损难以修复的问题，构建一种能在骨结核病灶部位持续释放抗结核药物，并能促进其骨组织修复的载药系统在骨结核的治疗中具有重大的研究意义。 本论文制备具有均一孔道、较大孔容和比表面积等特性及优异细胞转运性能的介孔Fe3O4空心纳米粒子（hollow mesoporous Fe3O4nanoparticles，HMFNs），以其为载体，构建能够同时负载疏水性药物利福平和亲水性药物异烟肼的纳米输送体系，实现不同特性药物的共载及缓释避免耐药性；同时研究HMFNs载体材料在“空载”的状态下结合正弦电磁场（sinusoidal electromagnetic fields，SEMF）调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）和前成骨细胞MC3T3-E1向成骨方向分化，实现化疗药物持续释放的同时促进骨缺损修复，为骨结核的治疗提供一种新方法。本论文主要研究内容如下： 1.采用一步水热法制备HMFNs，通过XRD、SEM、TEM和N2吸附-脱附等测试分析发现了该HMFNs具有介孔外壳和空心结构。并且通过MTT实验、乳酸脱氢酶泄露实验、溶血实验和细胞摄取实验证实了所得的HMFNs具有良好的细胞相容性和血液相容性以及能被细胞吞噬摄入等性能。 2.采用超临界二氧化碳成功将疏水性药物利福平注入到HMFNs空腔中，其载药量可达到18.25%。亲水性药物异烟肼能吸附在HMFNs介孔外壳上，其载药量为9.55%，并且该载药系统在体外具有一定缓释性能和磁响应性，可以作为磁靶向双重缓释载药体系。 3.结合正弦电磁场，研究HMFNs在体外调控BMSCs和MC3T3-E1细胞成骨分化效应，通过细胞增殖实验、ALP活性检测、细胞矿化、蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR等实验分析表明HMFNs和外磁场单独刺激BMSCs和MC3T3-E1细胞时，细胞的增殖、分化及矿化等行为无明显影响，但是HMFNs的胞吞结合外磁场刺激能够促进BMSCs和MC3T3-E1细胞成骨分化及矿化，具有成骨效应，尤其1mT和2mT磁场体外促进成骨分化效果最为显著。

目录

声明

主要缩略词

第一章 绪论

1.1引言

1.2 骨结核的现状

1.3纳米载药系统

1.3.1 磁靶向纳米载药系统

1.3.2 Fe3O4纳米材料的应用

1.4 微粒调控BMSCs成骨分化等行为

1.5 电磁场促进成骨的研究

1.5.1 电磁场调控干细胞成骨分化

1.5.2 电磁场调控成骨细胞分化

1.6 本课题研究目的、意义及主要研究内容

1.6.1 本课题的研究意义和目的

1.6.2 本课题的研究内容

1.6.3 本论文的创新点

第二章 介孔Fe3O4空心纳米粒子的制备及其生物相容性研究

2.1 前言

2.2主要实验试剂及仪器

2.2.1 主要实验试剂

2.2.2 主要实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 HMFNs的制备

2.3.2 HMFNs的形态及结构表征

2.3.3 MTT法检测细胞增殖情况

2.3.4 乳酸脱氢酶（LDH）泄露实验检测细胞毒性

2.3.6 体外溶血试验

2.3.7 细胞摄取

2.3.8 统计学分析

2.4 实验结果与分析

2.4.1 HMFNs的表征

2.4.2 MTT法检测细胞增殖情况

2.4.3 乳酸脱氢酶（LDH）泄露实验检测细胞毒性

2.4.4 细胞凋亡与坏死染色

2.4.5 体外溶血试验

2.4.6 HMFNs的细胞摄取

2.5 本章小结

第三章 介孔Fe3O4空心纳米粒子双重缓释载药系统的构建及其药物释放规律

3.1 前言

3.2主要实验试剂及仪器

3.2.1 主要实验试剂

3.2.2主要实验仪器

3.3 实验方法

3.3.2 HMFNs装载疏水性药物利福平（RFP）

3.3.3双重载药系统（HMFNs-RFP-INH）的构建及表征

3.3.4 体外药物释放规律

3.4 实验结果与分析

3.4.1 标准曲线绘制

3.4.2 双重载药系统的表征

3.4.3体外药物释放规律

3.5 本章小结

第四章 介孔Fe3O4空心纳米粒子在磁场作用下对BMSCs成骨分化的影响

4.1 前言

4.2主要实验试剂及仪器

4.2.1 主要实验试剂

4.2.2主要实验仪器

4.3 实验方法

4.3.1 溶液的配制

4.3.2 大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的提取与培养

4.3.3 电磁场装置及磁场参数介绍

4.3.4 HMFNs的细胞摄取

4.3.5 HMFNs在不同强度磁场作用下对BMSCs行为的影响

4.3.6 统计学分析

4.4 实验结果与分析

4.4.1 HMFNs的细胞摄取及分布结果

4.4.2 MTT法检测细胞增殖

4.4.3 BMSCs的形态观察

4.4.4 细胞内碱性磷酸酶活性检测及染色

4.4.5 细胞外基质矿化检测

4.4.6 实时荧光定量PCR检测分析（RT-PCR）

4.4.7免疫印迹试验（Western Blotting）

4.5 本章小结

第五章 介孔Fe3O4空心纳米粒子在磁场作用下对MC3T3-E1细胞行为的影响

5.1 前言

5.2 主要实验试剂及仪器

5.2.1 主要实验试剂

5.2.2主要实验仪器

5.3 实验方法

5.3.1 溶液的配制

5.3.2 MC3T3-E1小鼠前成骨细胞的培养

5.3.3 电磁装置及磁场参数介绍

5.3.4 HMFNs的细胞摄取

5.3.5 HMFNs在不同强度磁场作用下对MC3T3-E1细胞行为的影响

5.3.6 统计学分析

5.4 实验结果与分析

5.4.1 HMFNs的细胞摄取及分布结果

5.4.2 MTT法检测细胞增殖

5.4.3 MC3T3-E1细胞形态学观察

5.4.4 细胞内碱性磷酸酶活性检测及染色

5.4.5 细胞外基质矿化检测

5.4.6实时荧光定量PCR检测分析（RT-PCR）

5.4.7免疫印迹试验（Western Blotting）

5.5 本章小结

第六章 结论和展望

6.1 结论

6.2 不足与展望

致谢

参考文献

攻读硕士期间科研成果