丹参通过促进Nrf2表达抑制H2O2诱导的心肌细胞氧化损伤

摘要

目的:观察丹参对H2O2导致的大鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用，探讨丹参抗氧化损伤的分子机制。
　　方法:
　　1.建立H2O2氧化损伤模型:
　　1)大鼠心肌H9C2细胞加入不同浓度H2O2孵育相同时间后进行SRB检测，计算细胞生长抑制率，确定H2O2最佳孵育浓度。
　　2)大鼠心肌H9C2细胞加入相同浓度H2O2孵育不同时间后进行SRB检测，计算细胞生长抑制率，确定H2O2最佳孵育时间。
　　2.建立丹参抗氧化损伤模型:
　　1)大鼠心肌H9C2细胞加入不同浓度丹参孵育相同时间后加入H2O2处理，SRB检测计算细胞存活率，确定丹参最佳孵育浓度。
　　2)大鼠心肌H9C2细胞加入相同浓度丹参孵育不同时间后加入H2O2处理，SRB检测计算细胞活力，确定丹参最佳孵育时间。
　　3.大鼠心肌H9C2细胞分组处理后进行DAPI染色，显微镜下观察细胞数及细胞核形态变化。
　　4.通过实时荧光定量PCR检测Myocardin mRNA和Nrf2 mRNA的表达情况，观察H2O2及丹参处理后大鼠心肌H9C2细胞中Myocardin mRNA和Nrf2 mRNA的表达变化。
　　5.Western Blotting检测Myocardin蛋白和Nrf2蛋白的表达，研究H2O2及丹参对大鼠心肌H9C2细胞中Myocardin蛋白和Nrf2蛋白的影响。
　　6.观察Myocardin基因和Nrf2基因对细胞增殖的影响:分别过表达Myocardin基因和Nrf2基因后检测细胞增殖情况;下调Myocardin基因和Nrf2基因后检测细胞增殖情况。
　　7.观察Myocardin对Nrf2表达的影响:通过过表达Myocardin基因和下调Myocardin基因检测Nrf2基因mRNA和蛋白的表达情况。
　　结果:
　　1.200μM H2O2孵育24h最接近半数致死量，此时显微镜下观察细胞数较对照组明显减少，细胞核肿胀、同缩、碎裂多见，为最佳H2O2氧化损伤模型。
　　2.0.15mg/mL丹参预孵育1h可明显减轻H2O2所致心肌氧化损伤，此时显微镜下观察丹参+H2O2组细胞数较H2O2组增多，细胞核均一性以及细胞核肿胀、固缩、碎裂等状况均较H2O2组有好转。
　　3.H2O2抑制Myocardin mRNA及蛋白的表达，增加Nrf2 mRNA及蛋白的表达;而丹参进一步下调Myocardin mRNA及蛋白的表达，同时明显上调Nrf2 mRNA及蛋白的表达。
　　4.过表达Myocardin基因后检测相对活细胞数较对照组减少，而下调Myocardin基因后相对活细胞数较对照组增多;过表达Nrf2基因后检测相对活细胞数较对照组增多，而下调Nrf2基因后相对活细胞数较对照组减少。
　　5.过表达Myocardin基因后检测Nrf2 mRNA和Nrf2蛋白表达出现明显下调;而下调Myocardin基因后检测Nrf2 mRNA和Nrf2蛋白表达明显上调。
　　结论:
　　1.H2O2造成心肌细胞氧化损伤可激活Nrf2主导的抗氧化损伤信号通路。
　　2.丹参能抑制H2O2导致的氧化损伤，其作用机制可能是通过下调Myocardin基因表达及进一步促进Nrf2表达实现的。
　　3.Nrf2促进细胞增殖，Myocardin抑制细胞增殖，二者对细胞增殖表现为相反的作用。
　　4.Myocardin基因可能调控Nrf2基因的表达。

目录

声明

摘要

1、前言

2、实验材料与方法

2．1 实验细胞

2．2 主要质粒

2．3 实验试剂

2．3．1 大鼠心肌H9C2细胞培养相关试剂

2．3．2 建立H2O2氧化损伤及丹参抗氧化损伤模型相关试剂

2．3．3 DNA和RNA提取、PCR实验相关试剂

2．3．4 Western bloting法相关试剂及相关溶液配制

2．3．5 质粒转染相关试剂及配制

2．3．6 细胞染色相关试剂及配制

2．4 实验仪器

2．5 实验方法

2．5．1 细胞培养

2．5．2 细胞计数

2．5．3 实验技术

2．5．4 实验分组

2．5．5 实验步骤

2．5．6 统计学分析

3、结果

3．1 建立H2O2氧化损伤模型

3．1．1 确定H2O2孵育浓度

3．1．2 确定H2O2孵育时间

3．2 建立丹参抗氧化损伤模型

3．2．1 确定丹参孵育浓度

3．2．2 确定丹参孵育时间

3．3 H2O2氧化损伤及丹参抗氧化损伤过程中大鼠心肌H9C2细胞数及细胞核形态学改变

3．4 检测H2O2及丹参对大鼠心肌H9C2细胞中Nrf2 mRNA的影响

3．5 检测H2O2及丹参对大鼠心肌H9C2细胞中Nrf2蛋白的影响

3．6 Nrf2基因对细胞增殖的影响

3．7 Myocardin基因与氧化损伤及Nrf2基因的关系

3．7．1 检测三组细胞Myocardin mRNA的变化

3．7．2 检测H2O2及丹参对大鼠心肌H9C2细胞中Nrf2蛋白和Myocardin蛋白的影响

3．7．3 过表达Myocardin基因抑制细胞增殖

3．7．4 下调Myocardin基因促进细胞增殖，而下调Nrf2基因抑制细胞增殖

3．7．5 过表达Myocardin基因引起Nrf2 mRNA表达下调

3．7．6 Myocardin基因下调引起Nrf2基因mRNA表达上调

3．7．7 过表达Myocardin基因引起Nrf2基因蛋白表达下调

3．7．8 Myocardin基因下调引起Nrf2基因蛋白表达上调

4、讨论

5、结论与展望

致谢

参考文献

文献综述 Keapl-Nrf2-ARE通路与氧化应激相关性疾病

参考文献

附录1 攻读硕士学位期间发表的论文

附录2 攻读硕士学位期间参加的科研项目