奥拉帕尼类似物的合成、活性研究及PARP-1 & AChE双靶点抑制剂的虚拟筛选

摘要

目的:
　　1.以新上市的抗肿瘤药物奥拉帕尼为先导化合物，设计、合成新的(E)-4-{3-[4-[（3-取代芳香基）丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物，并评价其抑制PARP-1酶的活性及其对肿瘤细胞抗增殖能力的影响，以期获得的具有PARP-1抑制活性的新型靶向抗肿瘤化合物。鉴于PARP-1也可能是治疗AD的新型靶点，本研究同时也检测了目标化合物对AChE和BuChE的酶抑制活性，以评价其作为抗AD的多靶点配体的潜力。
　　2.以Pubchem数据库中现有的PARP-1抑制剂为筛选对象，通过计算机辅助药物设计技术，筛选出具有AChE抑制活性的小分子化合物，并进行分子动态模拟，以期获得具有PARP-1和AChE双靶点抑制的抗AD化合物，为新型抗AD药物研究提供基础。
　　方法:
　　1.目标化合物的设计和合成:保留奥拉帕尼的主要药效团，对分子尾部的环丙基进行改造。选取分子长度适宜且尾部链自由度较小的共轭结构—取代芳香基丙烯酰基结构，对环丙基进行结构替换，设计和合成16个奥拉帕尼类似物。其合成方法为:以2-甲酰基苯甲酸为原料，经环合、氧化、还原等反应，合成重要中间体2-氟-5-[（4-氧代-3，4-二氢酞嗪-1-基）甲基]苯甲酸;以取代的芳香甲醛为原料，与丙二酸发生Knoevenagel反应，得到取代芳香基丙烯酸，与1-叔丁氧羰基哌嗪发生酰胺反应，脱去保护基团叔丁氧羰基后，与2-氟-5-[（4-氧代-3，4-二氢酞嗪-1-基）甲基]苯甲酸发生酰胺化反应，得到目标产物。
　　2.目标化合物生物活性评价:(1)采用HT同源PARP荧光法抑制试剂盒(Trevigen，Cat＃4690-096-K)检测所合成的目标化合物对PARP-1酶的抑制活性，然后采用MTT法测定目标化合物对人结肠癌SW-620和人乳腺癌MDA-MB-436细胞增殖能力的影响;(2)采用Ellman法评价目标化合物对AChE和BuChE的抑制能力。
　　3.虚拟筛选:使用AutoDock Vina软件对具有PARP-1抑制活性的859个化合物进行虚拟筛选，寻找具有AChE抑制活性的潜力分子。使用GROMACS软件对目标分子进行动力学模拟，探究其分子识别机制和动态结合模式。
　　结果:
　　1.本研究设计、合成了16个(E)-4-{3-[4-[（3-取代芳香基）丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物，其结构通过1H-NMR、13C-NMR、IR和质谱进行了确证。
　　2.(E)-4-{3-[4-[（3-取代芳香基）丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物生物活性的评价:PARP-1酶活性的测试结果显示，化合物44d、44e、44n对PARP-1酶具有较强的抑制活性（IC50分别为41.50±2.65、37.90±1.89和16.10±1.25nM，阳性对照药奥拉帕尼的IC50为8.20±1.06nM）;MTT测试结果显示，化合物44d、44e、44n对具有BRCA基因缺陷的人乳腺癌MDA-MB-436细胞有较强的抑制增殖活性（IC50分别为10.25±2.20、13.95±1.28和11.62±2.15μM，阳性对照药奥拉帕尼的IC50为8.63±1.25μM），而对人结肠癌SW-620细胞无明显的抑制作用，提示化合物44d、44e、44n对PARP-1可能有较好的选择性和靶向性，特别是化合物44n值得进一步研究;采用Ellman法评价了目标化合物对AChE和BuChE的抑制作用。结果表明，化合物44d、44e、44n对AChE酶的IC50分别为27.44±0.46、12.24±0.49和24.55±1.10μM（阳性对照药甲基硫酸新斯的明的IC50为0.04±0.01μM），对BuChE酶的IC50分别为13.17±0.23、5.93±0.19和9.16±0.91μM（阳性对照药甲基硫酸新斯的明的IC50为12.01±4.05μM）。化合物44d、44e、44n对BuChE显示了较好抑制活性，而对AChE抑制作用稍弱。
　　3.使用AutoDock Vina软件虚拟筛选出10个目标化合物，其中8个化合物都具有吡咯并咔唑母核结构，该结构可能在AChE活性位点外周阴离子结合位点的分子识别中具有重要作用。CID71605390和CID57390505在与AChE的对接和分子动态模拟中显示出较高亲和力和稳定性。
　　结论及创新点:
　　1.本研究以奥拉帕尼为先导化合物，合成并确证了16个未见报道的(E)-4-{3-[4-[（3-取代芳香基）丙烯酰基]哌嗪-1-羰基]-4-氟苄基}-2H-酞嗪-1-酮衍生物。其中化合物44d、44e、44n对PARP-1酶具有较强的抑制活性，且对具有BRCA基因缺陷的人乳腺癌MDA-MB-436细胞具有较强的抗增殖活性，提示化合物44d、44e、44n对PARP-1具有较好的选择性和靶向性，特别是化合物44n值得进一步研究。其中化合物44d、44e、44n还对BuChE显示了较好抑制活性。
　　2.通过对Pubchem数据库中的PARP-1抑制剂进行虚拟筛选，初步筛选出具有较强AChE和PARP-1双靶点抑制作用的10个化合物，发现吡咯并咔唑母核结构可能在AChE活性位点外周阴离子结合位点的分子识别中具有较重要作用，并对目标化合物进行进一步的分子对接和分子动态模拟，优选出化合物CID71605390和CID57390505，为寻找用于治疗阿尔茨海默病的新型AChE和PARP-1双靶点抑制剂提供了新的思路。

目录

声明

摘要

前言

1 PARP-1与肿瘤

2 PARP-1抑制剂研究进展

3 PARP-1与阿尔茨海默病

第1章 奥拉帕尼类似物的设计、合成和表征

1 奥拉帕尼类似物的设计

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果与讨论

2 目标化合物合成

2．1 仪器与试剂

2．2 方法与结果

2．3 讨论

第2章 合成衍生物的生物活性及构效关系分析

1．2 试剂的配制

1．3 方法

1．4 数据处理

1．5 结果与讨论

2 目标化合物对人结肠癌和人乳腺癌细胞增殖能力的影响

2．1 材料和仪器

2．2 方法

2．3 数据处理

2．4 结果

3 目标化合物对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性的抑制作用

3．1 材料和仪器

3．2 试剂配制

3．3 方法

3．4 数据处理

3．5 结果与讨论

第3章 基于PARP-1酶和AChE双靶点抑制剂的计算机辅助药物筛选

1 材料和方法

1．1 计算机辅助药物筛选

1．2 筛选结果的再对接(Re-docking)

1．3 分子动态模拟(MD)

2 结果和讨论

结论与展望

参考文献

综述 PARP抑制剂在抗肿瘤方面的研究进展

致谢

附录