玉米种子萌发过程中rRNA基因和VP1基因的组蛋白修饰变化

摘要

种子萌发是种子的胚从相对静止状态转变为生理活跃状态的生命活动，这过程受到细胞内外许多因素的调节。组蛋白修饰是指组蛋白的N-末端氨基酸残基发生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚ADP糖基化等多种共价修饰作用，这些修饰影响着染色质的结构或者影响着调控蛋白的结合从而调控着基因的转录活性，最近研究发现组蛋白修饰在种子萌发过程中具有重要作用。核糖体RNA(rRNA)基因是维持细胞生命活动的重要基因，它转录生成的rRNA是核糖体的重要成分，对于核糖体的产生和蛋白质的合成有重要作用，是种子萌发所必需的。Viviparous1(VP1)基因是调控玉米种子成熟的关键基因，VP1基因突变会引起种子对ABA敏感性降低，不能正常成熟和萌发。本文以萌发过程中的玉米种子为材料，分析种子萌发过程中组蛋白修饰的变化以及组蛋白修饰对rRNA基因和VP1基因转录的影响，结果如下: 1.利用免疫染色和western blot技术分析玉米种子萌发过程中组蛋白修饰含量的变化，结果显示在玉米种子萌发过程中组蛋白H3K9ac修饰、组蛋白H44Kac修饰和组蛋白H3K9me1修饰含量逐渐升高，组蛋白H3K9me2修饰含量保持不变。组蛋白乙酰化修饰由组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶调控，利用荧光定量PCR技术分析组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶在玉米种子萌发过程中表达量的变化，结果显示组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶在玉米种子萌发过程中表达量逐渐升高。使用外源激素ABA处理萌发过程中的玉米种子能明显抑制组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶的表达并且导致组蛋白H3K9ac修饰的降低，进一步使用不同浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理萌发过程中玉米种子发现TSA引起组蛋白H3K9ac修饰升高，并且对玉米种子萌发和胚根的生长有明显的抑制作用，抑制效果随着浓度的增加而增强，这些结果表明组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶对玉米种子萌发有重要影响。 2.利用荧光原位杂交和荧光定量PCR技术分析玉米种子萌发过程中rDNA染色质结构和rRNA基因的表达量变化，结果显示在种子萌发过程中rDNA染色质逐渐脱浓缩并且伴随着rRNA基因的表达量逐渐升高，在萌发后48小时rDNA染色质脱浓缩最明显，与此同时rRNA基因的表达量达到最大值。利用免疫染色和荧光原位杂交相结合技术分析种子萌发过程中rDNA染色质部位的组蛋白H3K9ac修饰和组蛋白H3K9me2修饰的变化，结果显示干种子中rDNA染色质部位与组蛋白H3K9me2修饰相联系，缺乏组蛋白H3K9ac修饰，在萌发48小时种子中rDNA染色质部位存在着组蛋白H3K9me2修饰和组蛋白H3K9ac修饰。利用染色质免疫沉淀技术分析玉米种子萌发过程中rRNA基因相联系的组蛋白H3K9ac修饰和组蛋白H3K9me2修饰的变化，结果显示rRNA基因启动子部位组蛋白H3K9ac修饰逐渐升高，组蛋白H3K9me2修饰不变，rRNA基因的18S和28S区域组蛋白H3K9ac修饰和组蛋白H3K9me2修饰都不变。使用外源激素ABA处理萌发过程中的玉米种子能抑制rDNA染色质脱浓缩和rRNA基因表达量的升高并且伴随着rRNA基因启动子部位的组蛋白H3K9ac修饰的降低，这些结果表明玉米种子萌发过程中rDNA染色质脱浓缩与rRNA基因表达相联系，并且它们都受到组蛋白H3K9ac修饰的影响。 3.利用荧光定量PCR技术分析玉米种子萌发过程中VP1基因的表达量变化，结果显示在种子萌发过程中VP1基因表达量逐渐降低;利用染色质免疫沉淀技术分析种子萌发过程中VP1基因的组蛋白H3K9ac修饰的变化，结果显示VP1基因启动子部位组蛋白H3K9ac修饰在种子萌发过程中逐渐降低;使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA和外源激素ABA分别处理萌发过程中的玉米种子能抑制VP1基因的降低，引起VP1基因的启动子部位组蛋白H3K9ac修饰升高，表明玉米种子萌发过程中组蛋白去乙酰化酶抑制VP1基因的表达，ABA可能通过影响组蛋白去乙酰化酶的活性调控着VP1基因的表达。

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摘要

缩写符号

第一章前言

1种子的萌发和休眠

1．1种子萌发的过程

1．2 ABA对种子萌发的影响

2表观遗传学

2．1表观遗传学定义

2．2 DNA甲基化

2．3组蛋白乙酰化

3核糖体DNA

3．1核糖体DNA的结构和功能

3．2 rRNA基因的转录和沉默

3．3 rRNA基因转录的表观遗传学机制

4 Viviparous1基因

5本研究的目的和意义

第二章材料和方法

1．3主要试剂

1．4引物序列

2实验方法

2．1荧光原位杂交

2．2免疫染色

2．3荧光定量PCR

2．4蛋白质印记

2．5染色质免疫沉淀

第三章结果与分析

1．1玉米种子萌发过程中组蛋白修饰的变化

1．2 ABA处理萌发过程中的玉米种子抑制组蛋白H3K9ac修饰的升高

1．3 TSA处理萌发过程中的玉米种子引起组蛋白H3K9ac修饰的升高

2 ABA处理萌发过程中的玉米种子对rDNA染色质结构、rRNA基因表达及其相联系的组蛋白修饰的影响

2．1玉米种子萌发过程中rDNA染色质构象及rRNA基因表达量的变化

2．2玉米种子萌发过程中rDNA染色质部位组蛋白修饰的变化

2．3 ABA处理抑制rDNA染色质脱浓缩和rRNA基因表达

2．4 ABA处理引起rRNA基因组蛋白H3K9ac修饰降低

3 ABA或TSA处理萌发过程中的玉米种子对VP1基因表达及其相联系的组蛋白修饰的影响

3．2 ABA或TSA处理引起VP1基因组蛋白H3K9ac修饰升高

第四章讨论

1组蛋白乙酰化修饰对种子萌发的影响

2种子萌发和rRNA基因表达

3 rDNA染色质结构、rRNA基因表达与组蛋白修饰相联系

4 TSA对种子萌发的影响

5组蛋白去乙酰化酶参与ABA信号通路

参考文献

在读期间发表文章

致谢