嗜盐古生菌Natrinema sp.J7--2全基因组分析及其分泌蛋白质组初步研究

摘要

Natrinema sp.J7-2是一种可以在不添加氨基酸的人工合成培养基上生长的极端嗜盐古生菌。本研究测定了该菌的全基因组，这是第一个完整测定基因组的Natrinema属菌株。在此基础上，利用该菌基因组信息，我们采用合成培养基对该菌进行培养实验，对其碳、氮源代谢途径和氨基酸合成途径进行了全面分析。结果表明，Natrinema sp.J7-2的基因组由一个3，697，626-bp的染色体和一个95，989-bp的质粒pJ7-Ⅰ组成。Natrinema sp.J7-2可以利用葡萄糖、甘油或者乙酸作为唯一碳源进行生长，我们从它的基因组数据中也鉴定到了代谢和异生这些化合物的代谢途径。同时，我们重构了该菌20种氨基酸的合成途径，发现嗜盐古生菌的精氨酸合成途径和细菌的赖氨酸合成途径之间可能存在演化关系。利用合成培养基进行的生长实验和基因组分析显示，该菌具有利用铵盐和亚硝酸盐的能力和途径。但是，Natrinema sp.J7-2不能利用硝酸盐作为唯一氮源生长，在其基因组中也没有找到利用硝酸盐的相关基因。同时，该菌具有一个不完整的反硝化作用途径，可以将亚硝酸还原为N2O。此外，我们还利用比较基因组的方法对已知的嗜盐古生菌基因组进行了分析。结果显示，嗜盐古生菌主要利用TrkAH系统来摄取钾离子，而Kdp系统可能只是在低浓度钾离子条件下主动转运胞外的钾离子到胞内。Natrinema sp.J7-2基因组含有三个CRISPR结构，其中之一位于一个整合区域之中，可能通过水平基因转移在不同物种间转移。我们还对已测定基因组的嗜盐古生菌进行了基因组系统进化分析，为全面了解嗜盐古生菌或其基因的垂直和非垂直进化提供了新线索。 以往关于嗜盐古生菌基因组预测分析结果表明，尽管嗜盐古生菌同时具备Tat和Sec分泌系统，它们广泛采用Tat途径分泌胞外蛋白，并且很多Tat底物为脂蛋白，这被认为是嗜盐古生菌在分泌机制方面不同于其他古生菌和细菌的独特之处。为了探究Tat和Sec分泌系统在嗜盐古生菌胞外蛋白质分泌过程中的作用，我们在对Natrinema sp.J7-2基因组中分泌蛋白进行预测分析的基础上，利用RPLC-ESI-MS/MS技术对该菌分泌的胞外蛋白和膜蛋白进行了研究。我们对该菌对数生长中期和稳定期前期的样品进行了分析，结果显示，通过质谱技术所检测到的胞外蛋白质的种类和数量远少于基因组预测的结果。在J7-2菌株培养物胞外组分中检测到的带有Tat和Sec信号肽的分泌蛋白分别有21个和12个，主要包括水解酶类、胞外溶质结合蛋白和细胞表面结构相关蛋白等。在胞外组分中检测到的不含Tat和Sec信号肽的蛋白中，有4个具有Ⅰ型分泌系统底物的信号序列，从功能预测分析看也在胞外行使功能。这暗示在Natrinema sp.J7-2中可能存在除Tat和Sec分泌系统以外的蛋白转运系统。在膜组分样品中，通过质谱技术所检测到带有Tat信号肽的蛋白有28个，这些Tat底物主要为具有Lipobox结构并结合于膜外表面的脂蛋白。还有28个带有Sec信号肽的蛋白在膜组分样品中被检测到，这些Sec底物主要为含有多个跨膜区的膜蛋白，这显示See信号肽在膜蛋白的定位过程中也发挥重要作用。另外，我们根据质谱检测结果，对Natrinema sp.J7-2的S层蛋白、转运体和离子通道、感应和运动蛋白等的功能及适应机制也分别进行了分析。 为了进一步探究Tat和Sec信号肽在嗜盐古生菌胞外蛋白质分泌过程中的作用和机制，我们将Natrinema sp.J7-2中带有Sec信号肽的胞外蛋白酶SptE和带有Tat信号肽的胞外蛋白酶SptA基因进行克隆和表达，并对这两个带有不同信号肽的胞外蛋白酶进行了信号肽替换实验，以观察不同信号肽对这两个蛋白分泌的影响。结果表明:将SptA的Tat信号肽替换为Sec信号肽后，在重组菌培养物胞外上清及细胞表面均未检测到蛋白酶活性;当SptE的Sec信号肽替换为Tat信号肽后，在培养物细胞表面能够检测到蛋白酶活性。这表明，嗜盐古生菌的Tat分泌系统不仅可以分泌折叠蛋白，也具有分泌去折叠蛋白的能力。

目录

声明

本研究主要创新点

摘要

第一章前言

1．1．嗜盐古生菌的基本生物学特征

1．1．1高盐环境中的微生物

1．1．2．嗜盐古生菌的发现与分类

1．1．3．嗜盐古生菌的形态、结构与生长特点

1．1．4．嗜盐古生菌对高盐环境的适应性

1．2．1．物质代谢

1．2．2．能量代谢

1．3．古生菌蛋白质的跨膜转运

1．3．1．古生菌的细胞膜和细胞壁

1．3．2．古生菌蛋白的分泌途径

1．3．3．古生菌的信号肽

1．4．基因组和基因组学

1．4．1．基因组学和基因组测序技术

1．4．2．微生物基因组学

1．4．3．微生物功能基因组学

1．4．4．古生菌基因组进化与比较基因组学

1．5．蛋白质组学和分泌蛋白质组

1．5．1．蛋白质组学

1．5．2．质谱技术在蛋白质组学中的应用

1．5．3．古生菌分泌蛋白质组研究

1．6．本研究的背景、目的及内容

1．6．3．研究内容

第二章材料与方法

2．1．实验材料

2．1．1．菌株

2．1．2．质粒

2．1．3．序列

2．1．4．药品及试剂

2．1．5．培养基

2．1．6．溶液和抗生素的配制

2．1．7．仪器

2．1．8．数据库和程序

2．2．实验方法

2．2．1．嗜盐古生菌基因组DNA的制备

2．2．4．代谢途径构建

2．2．5．基因组进化分析

2．2．6．功能区预测

2．2．7．电镜样品制备

2．2．8．嗜盐古生菌胞外蛋白样品制备

2．2．9．嗜盐古生菌膜蛋白样品制备

2．2．10．RPLC-ESI-MS／MS分析样品的制备

2．2．11．C18 SepPak反相柱脱盐

2．2．12．RPLC-ESI-MS／MS数据处理

2．2．13．PCR反应

2．2．14．碱裂解法制备质粒DNA

2．2．16．沃氏富盐菌(H．volcanii)的转化

2．2．17．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2．2．18培养物胞外蛋白酶活性测定

第三章Natrinema sp．J7-2基因组分析

3．1．引言

3．2．Natrinema sp．J7-2基因组概况

3．3．整合、插入与转座

3．3．1位点特异性整合酶

3．3．2．整合区域(Integrated element)

3．3．3．基因组中的插入序列

3．4．CRISPR／Cas系统

3．5．碳源的利用

3．5．1．葡萄糖和葡萄糖酸的利用

3．5．2．甘油和乙酸的利用

3．5．3．丙酸的代谢

3．5．4．PHA(Polyhydroxyalkanoates)的合成

3．6．二氧化碳的固定

3．7．氨基酸合成途径

3．7．1．谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成

3．7．2．赖氨酸和精氨酸的合成

3．7．3．脯氨酸的合成

3．7．4．丙氨酸的合成

3．7．5．组氨酸的合成

3．7．6．丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的合成

3．7．7．芳香族氨基酸的合成

3．8．氮源的利用

3．9．转运体和离子通道

3．10．1．嗜盐古生菌的16S rRNA系统进化树

3．10．2．嗜盐古生菌的基因组进化分析

3．10．3．特定基因的进化分析

3．11．本章小结

第四章Natrinema sp．J7-2分泌蛋白的基因组预测分析和蛋白质组分析

4．1．引言

4．2．结果与分析

4．2．1．Natrinema sp．J7-2分泌系统及其底物的生物信息学分析

4．2．2．Natrinema sp．J7-2细胞表面结构的电镜观察

4．2．3．Natrinema sp．J7-2的分泌蛋白及膜蛋白的蛋白质组分析

4．3．讨论

4．3．1．Natrinema sp．J7-2培养物胞外蛋白的组成

4．3．2．Natrinema sp．J7-2培养物膜蛋白的组成

4．3．3．Sec途径和Tat途径分泌蛋白的比较

4．3．4．不含信号肽的胞外蛋白

4．3．5．S层蛋白

4．3．6．转运体和通道蛋白

4．3．7．信号传导和鞭毛组分

第五章Natrinema sp．J7-2胞外蛋白酶分泌的初步研究

5．1．引言

5．2．结果与分析

5．2．1．Natrinema sp．J7-2基因组中的蛋白酶的种类

5．2．2．蛋白酶基因的克隆及信号肽互换嵌合体的构建

5．2．3．重组菌株胞外蛋白酶的活性检测

5．3．讨论

展望

参考文献

致谢