拟南芥bHLH112基因参与侧根发育调控和盐胁迫应答的研究

摘要

植物发达的根系统负责将其固定在土壤中，承担吸收土壤中水分和营养物质的重要作用。为了更好的适应环境，在获取营养和避害之间维持平衡，植物会精细地调控其根系统的发育，尤其是侧根的发生。因此，研究侧根发生的调控机制对改善植物的生存能力，更好地利用土地资源有重要意义，一直是研究的热点。相对于侧根起始调控的研究，前人对侧根突出过程调控机制的研究不够深入。 通过对一个未知功能的bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子bHLH112的探索性研究，初步揭示了其在拟南芥发育中的作用，并重点对其在侧根突出过程中与生长素信号的互作进行了较为细致的探索。研究结果主要有以下几点: 1.对bHLH112基因的表达模式进行了较为详细的分析。半定量PCR和bHLH112启动子驱动的GUS报告基因检测结果显示，bHLH112表达广泛，在莲座叶、茎和茎生叶中表达较高，主要在成熟维管组织和表皮毛中表达。通过荧光定量PCR的方法研究了各种激素和非生物胁迫处理对野生型中bHLH112基因表达的影响，揭示了bHLH112可能参与SA和ABA介导的生理过程和对盐胁迫的应答。还验证了bHLH112蛋白作为一个预测转录因子的细胞核定位情况。 2.对bHLH112基因的过量表达株系和功能缺失突变体表型进行了分析。与野生型相比b HLH112过量表达株系幼苗有明显的少侧根表型，显微观察发现，侧根数量的减少是由于侧根突出受到了抑制。过量表达株系中出现大量形态异常的原基，顶端平钝，滞留在主根内皮层中。 3.研究了bHLH112过量表达株系中侧根发育异常与生长素的相关性，验证了bHLH112通过影响生长素信号调控侧根的突出。DR5∷GUS染色结果显示了过量表达株系中侧根原基突出过程中生长素信号逐渐减弱，原基临近处主根皮层和表皮细胞的生长素信号降低。外源施加生长素能够回复该部位的生长素信号，同时也能够回复b HLH112过量表达株系少侧根的表型。随后检测了根中生长素相关基因表达水平，发现bHLH112过量表达株系中与侧根突出相关且受生长素诱导的部分细胞壁重塑酶基因表达水平与野生型相比显著降低。 4.初步验证了bHLH112参与拟南芥对盐胁迫的应答。bHLH112过量表达株系对低浓度NaCl处理的敏感性高于野生型，表现为子叶绿化被抑制程度加强和侧根数目的急剧减少。同时，在NaCl处理条件下，bHLH112过量表达株系中盐应答相关基因的表达量也高于野生型，证明bHLH112正调控盐应答相关基因的表达。 通过以上研究，证明了bHLH112转录因子可能参与了多种胁迫相关生理过程，如正调控拟南芥对盐胁迫的应答。bHLH112在根中特异的在突出阶段抑制侧根的发育，这一作用是通过降低侧根原基及其外侧生长素浓度，进而抑制细胞壁重塑酶基因表达来实现的。 我们的研究填补了bHLH转录因子家族亚家族X成员生物学功能研究的空白，论证了侧根突出过程中生长素的作用模式，并可能为拟南芥在胁迫条件下如何通过影响生长素来塑造其根系统形态提供了有价值的线索。

目录

声明

摘要

本论文缩略词表

1引言

1．1侧根的生长发育及其调控机制

1．1．1根的结构

1．1．2侧根的发生

1．1．3影响侧根发生的因素

1．2植物对盐胁迫的应答反应

1．3 bHLH家族的研究进展

2材料与方法

2．1材料及培养条件

2．2本研究中使用的bHLH112序列相关引物及载体上引物

2．3 RNA的提取和mRNA的反转录

2．3．1 RNA的提取

2．3．2 mRNA的反转录

2．4基因组DNA提取

2．5大肠杆菌的感受态制备及转化

2．6农杆菌的感受态制备及转化

2．7农杆菌介导的拟南芥转化

2．8重组质粒的构建及转基因株系的筛选

2．8．1小量质粒提取

2．8．2 DNA片段凝胶纯化回收

2．8．3线性载体去磷酸化

2．8．4 pbHLH112∷GUS转基因株系的构建

2．8．5 35S∷bHLH112-GFP转基因株系的构建

2．8．6 bHLH112基因过量表达株系的构建

2．9 bHLH112功能缺失突变体的获得

2．10 GUS染色

2．11半定量PCR检测

2．12定量PCR检测基因的表达量

2．12．1荧光定量PCR

2．12．2本研究中使用的定量PCR引物

2．13激光扫描共聚焦显微镜观察GFP融合蛋白亚细胞定位

2．14地上部分鲜重和主根长的统计

2．15侧根数目及侧根原基的观察统计

2．16 bHLH112过量表达株系与生长素标记株系DR5∷GUS的杂交

2．17 sos3-1 bhlh112-2双突变的获得

3结果与分析

3．1．2 bHLH112基因的启动子融合GUS基因显示bHLH112表达模式

3．1．3各种激素和非生物胁迫处理条件下bHLH112基因的表达变化

3．1．4 bHLH112蛋白亚细胞定位

3．2 bHLH112过量表达株系和功能缺失突变体的获得及表型分析

3．2．2 bHLH112基因功能缺失突变体的鉴定

3．2．3 bHLH112基因过量表达株系的表型分析

3．2．4 bHLH112基因功能缺失突变体的表型分析

3．3．1过量表达株系bHLH112ox-1中DRS∷GUS的染色结果

3．3．2外源施加IAA对bHLH112过量表达株系及功能缺失突变体主根根长的影响

3．3．3外源施加IAA能够回复bHLH112过量表达株系少侧根表型

3．3．4外源旋加IAA能够回复bHLH112过量表达株系侧根原基附近DR5∷GUS的染色

3．3．5外源施加IAA对bHLH112功能缺失突变体侧根密度的影响

3．3．6 bHLH112过量表达株系中生长素途径相关基因的表达情况

3．3．7生长素处理对CWR基因表达水平的影响

3．4 bHLH112参与拟南芥对盐胁迫的应答

3．4．1 bHLH112过量表达株系及功能缺失突变体盐胁迫处理条件下的表型

3．4．2盐胁迫处理条件下过量表达株系中盐胁迫相关基因的表达情况

3．4．3 sos3-1突变体在盐胁迫条件下bHLH112的表达情况以及sos3-1 bhlh112-2双突变的表型

4讨论

4．2过量表达bHLH112抑制拟南芥幼苗的生长

4．3bHLH112理抑制侧根发育通过影响生长素信号

4．4 bHLH112参与了拟南芥对盐胁迫的应答

4．5结论与展望

参考文献

在读期间发表及投稿论文

致谢