细胞层组织工程模拟构建颞下颌关节滑膜的实验研究

摘要

颞下颌关节紊乱病(TMD)可导致关节软骨及关节盘的退行性改变，而在此过程中颞下颌关节(TMJ)滑膜衬里层中的成纤维样滑膜细胞(FLSs)功能异常或凋亡，导致滑膜失去正常分泌功能。FLSs在滑膜细胞中占绝大多数，存在于滑膜衬里中并呈三至四层的排列结构。正常时FLSs胞膜上的透明质酸合成酶2(HAS2)合成透明质酸(HA)，FLSs负责滑膜组织的正常分泌功能，营养关节软骨;而在TMD时FLSs的分泌功能异常(例如分泌炎症因子及基质金属降解酶类)或凋亡，导致滑膜正常分泌功能的丧失，继而关节软骨失去营养，并遭受降解破坏。因而，构建一个具有正常HA分泌功能的组织工程滑膜，替换病理性的滑膜组织，可能成为治疗TMD的新方法。 根据温敏细胞层技术构建具有多层细胞结构这一理论设计的滑膜细胞层不能准确地模拟滑膜衬里层的细胞层外基质成分，因为细胞层技术依赖高密度细胞分泌的细胞外基质将细胞粘结在一起，而Ⅰ型胶原占据滑膜胶原总量的一半，FLSs主要分泌HA，而非Ⅰ型胶原。因此，本研究拟通过一种新的方法构建能够模拟滑膜衬里层的多层结构细胞层。本研究包括以下四个部分: 第一部分：细胞培养及其鉴定 实验一 人类颞下颌关节成纤维样滑膜细胞及真皮成纤维细胞的体外培养 目的:获得人类颞下颌关节正常的FLSs及作为对照的人类真皮成纤维细胞，以供构建细胞层使用。 方法:正常滑膜组织取自三位髁突骨折手术患者，真皮组织块取自唇腭裂修复术的患者，使用组织块法进行细胞培养。 结果:FLSs大约在3～5d时可从组织块中爬出，呈梭形，2w后，细胞即可达到80％汇合，传代后大约4d即可继续传代。真皮成纤维细胞活性较好，传代后一般2～3d即可再次传代。 结论:组织块法培养两种细胞，方法简单，重复性高，细胞活性好，可用于后续实验。 实验二 成纤维样滑膜细胞与真皮成纤维细胞的免疫细胞化学鉴定 目的:鉴定FLSs及真皮成纤维细胞(DFs)。 方法:通过细胞免疫化学的方法鉴定上述两种细胞。 结果:FLSs阳性表达vimentin、CD44，Hsp27，阴性表达CD14;真皮成纤维细胞阳性表达vimentin，阴性表达cytokeratin15。 结论:通过组织块法培养的FLSs为B型滑膜细胞，真皮成纤维细胞为真皮来源而非上皮来源。 第二部分：细胞层的构建及其与天然滑膜的形态学对比观察 实验三 甲基纤维素溶液的制各与凝胶温度的测定 目的:测试逆向温敏材料甲基纤维素(MC)的温敏特性。 方法:制备含有不同浓度PBS及不同浓度MC的MC混合溶液，按照倾斜试管法测定其凝胶温度(GT)。 结果:随着MC浓度的增高，MC混合溶液的GT降低;增加PBS的浓度也能够降低GT。实验组“5％MC，8％PBS”的GT为20.5℃。 结论:实验组“5％MC，8％PBS”的GT较适合，可用于后续实验。 实验四 三层结构细胞层的构建 目的:使用新的方法构建三层结构的细胞。 方法:第一种方法通过一种原创的方式结合Ⅰ型胶原与FLSs;第二种方法先在孔板中心滴加MC，再在其上结合第一种方法制造三层结构的细胞层。 结果:第一种无MC的细胞层制备方法稳定，成功率高，而第二种有MC的细胞层制备方法不如第一种稳定，偶尔Ⅰ型胶原会与孔壁提前分离。 结论:第一种制造三层结构细胞层的方法，制作原料及获取简单，重复性高，可用于后续实验。 实验五 细胞层与人类正常滑膜的形态学观察 目的:寻找三层结构滑膜细胞层与人类正常滑膜的形态学相似性。 方法:使用无MC的方法制造具有三层细胞结构滑膜细胞层，收集正常滑膜组织。进行苏木素伊红(HE)染色及透射电镜观察。 结果:细胞层与正常滑膜的衬里层均含有3～4层平行排列的高密度梭形细胞，相互接触的细胞之间未见桥粒、半桥粒或缝隙连结之类的细胞连结结构。 结论:三层结构的细胞层与天然滑膜衬里层在形态学上的相似。 实验六 正常滑膜与颞下颌关节退行性变滑膜的形态学观察 目的:对比分析人类正常滑膜与TMJ退行性变时滑膜的形态结构特征。 方法:正常滑膜来自3位髁突骨折患者，病理性滑膜来自10位骨关节病患者，常规组织学处理，HE染色。 结果:正常滑膜衬里层由3～4的长梭形滑膜细胞组成。而退行性变时的滑膜呈现出几种不同的表现，衬里层可增厚至约10层细胞也可保持3～4层，抑或衬里层中的细胞凋亡大幅减少，滑膜下层大多情况可见血管增多，少数病例可正常。 结论:TMJ OA退行性变时滑膜衬里层在形态上异常，有待组织工程滑膜的替换修复。 第三部分：细胞层的功能检测 实验七 细胞层的酶联免疫吸附试验(ELISA) 目的:检测各种不同细胞层的HA分泌量 方法:分组为普通培养的FLSs(对照)、单层的FLSs细胞层、三层的FLSs细胞层以及三层的DFs细胞层，使用ELISA法测定培养基中HA的分泌量。 结果:三层FLSs细胞层的HA分泌量高于其他组，在第1d和第3d时，该组的HA分泌量分别是单层FLSs细胞层HA分泌量的2.53倍和3.27倍。 结论:FLSs具有分泌透明质酸的功能，FLSs培养在Ⅰ型胶原上能分泌更多的HA。三层结构的FLSs细胞层能分泌大约3倍的HA。 实验八 细胞增殖活性实验 目的:比较不同培养方式的FLSs的细胞增殖活性。 方法:分组为普通培养FLSs、单层FLSs细胞层和三层FLSs细胞层，使用CCK-8法测定各组的细胞增殖活性。 结果:单层FLSs细胞层的OD值在第3d时高于普通培养组的OD值。三层FLSs细胞层的OD值在第1d和第3d时均显著高于其他两组。 结论:FLSs在Ⅰ型胶原上的增殖活性高于其在普通平板培养上的活性，FLSs在三层结构细胞层的培养环境中具备增殖活性。 实验九 Realtime-PCR检测HAS2基因在不同细胞层中的表达 目的:对比不同细胞层的HAS2基因表达情况。 方法:分组普通培养FLSs组、单层FLSs细胞层组、三层FLSs细胞层组及三层DFs细胞层组，通过Realtime-PCR法检测各组HAS2基因的表达。 结果:HAS2的表达在单层FLSs细胞层中显著高于普通培养组，HAS2表达在三层FLSs细胞层中表达量最高。 结论:Ⅰ型胶原能促进FLSs表达更高水平的HAS2基因，同时三层结构细胞层的三维培养方式能使FLSs中HAS2基因表达最高。 实验十 RT-PCR检测天然滑膜与人工滑膜HAS2基因的表达差异 目的:对比人类正常滑膜与三层FLSs细胞层(人工滑膜)在HAS2基因的表达。 方法:收集髁突骨折手术患者的滑膜组织，及三层FLSs细胞层，使用RT-PCR法检测HAS2基因表达情况。 结果:HAS2基因在人工滑膜中的表达略高于其在人类滑膜中的表达，但二者没有统计学差异。 结论:人工滑膜与人类滑膜在HAS2表达上无差异。 第四部分：裸鼠皮下移植实验 实验十一 细胞层的裸鼠皮下移植研究 目的:探索三层FLSs细胞层再裸鼠皮下环境中的存活及功能表达情况。 方法:将Ⅰ型胶原、脱细胞真皮及三层结构的FLSs细胞层植入裸鼠皮下，1w及2w周处死，组织学与免疫组化处理观察。 结果:1w时，Ⅰ型胶原与脱细胞真皮中的胶原遭受降解，三层FLSs与起支持作用的Ⅰ型胶原分离。2w时，对照组的植入物均降解消失，而在细胞层植入组，多层平行排列的细胞位于支持胶原表面，而支持胶原中有宿主成纤维细胞和血管的侵入。CD44与HAS2表达于支持胶原表面层状排列的细胞中。HA表达于CD44阳性细胞的细胞外基质中。 结论:三层结构的FLSs细胞层在裸鼠皮下环境中，较对照组具有更强的抵抗胶原降解的能力。在体内环境中FLS保持分化特性，具有合成与分泌HA的功能。 小结：本研究首次对颞下颌关节滑膜进行组织工程构建，并使用了一种独创的方法构建滑膜细胞层，使得三层结构的滑膜细胞层在形态上与天然颞下颌关节滑膜衬里层相似。功能检测证实，三层结构的滑膜细胞层具有合成与分泌透明质酸的能力。裸鼠皮下移植实验证实三层结构的滑膜细胞层具有抗降解的能力，并保持分泌透明质酸的功能。

目录

声明

摘要

引言

文献综述一:细胞层技术构建功能性组织的研究进展

文献综述二:透明质酸结构与功能的研究进展

第一部分细胞培养及其鉴定

实验一颞下颌关节成纤维样滑膜细胞及真皮成纤维细胞的体外培养

实验二成纤维样滑膜细胞与真皮成纤维细胞的免疫细胞化学鉴定

第二部分细胞层的构建及其与天然滑膜的形态学对比观察

实验三甲基纤维素溶液的制备与凝胶温度的测定

实验四三层结构细胞层的构建

实验五细胞层与人类正常滑膜的的形态学观察

实验六正常滑膜与颞下颌关节退行性变滑膜的形态学观察

第三部分细胞层的功能检测

实验七细胞层的酶联免疫吸附试验(ELISA)

实验八细胞增殖活性实验

实验九Realtime-PCR检测HAS2基因在不同细胞层中的表达

实验十RT-PCR检测天然滑膜与人工滑膜HAS2基因的表达差异

第四部分裸鼠皮下移植实验

实验十一细胞层的裸鼠皮下移植研究

参考文献

中英文缩略词表

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博士期间发表的论著

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