NOX4调节血管外膜成纤维细胞表型转化的相关机制研究

摘要

在冠心病(CHD)的治疗过程中，无论是经皮冠脉介入治疗(PCI)还是冠脉旁路移植术(CABG)，其疗效都受到再狭窄(restenosis)的威胁。冠脉术后再狭窄是一个非常复杂的过程，有多种细胞、因子参与其中。近年来，人们发现血管外膜成纤维细胞(AF)在再狭窄形成过程中起到重要的作用。AF在多种因素刺激下发生表型转化是其参与再狭窄过程的关键。虽然具体分子机制目前仍不完全清楚，TGFβ1仍被认为是诱导AF发生表型转化的最重要的刺激因子，是构建AF表型转化模型的主要工具。目前已有研究发现NADPH氧化酶4(NOX4)在心血管系统中存在显著表达，并通过产生活性氧族(ROS)参与多种细胞内生理，病理过程。但NOX4是否参与AF表型转化过程及其分子机制是什么目前仍未不清楚。本研究旨在探讨NOX4在AF表型转化过程中的作用以及可能的分子机制。为成功防治冠脉术后再狭窄提供新的靶点。 第一部分 大鼠胸主动脉血管外膜成纤维细胞培养 目的:获得可用于进一步实验研究的原代血管外膜成纤维细胞。 方法:购买自武汉大学实验动物中心SD大鼠经断颈处死后在无菌条件下剪取胸主动脉，剥取外膜剪成1mm×1mm大小组织块，进行贴块法培养。所获取的细胞进行免疫组化鉴别。对于分选出来的AF进行传代，冻存以备下一步实验。 结果:应用大鼠胸主动脉外膜组织块贴块法进行原代细胞培养，所获得的细胞呈梭形或三角形，经过免疫组化鉴定发现细胞内α-SMA表达呈阴性，波形蛋白表达呈阳性。该细胞符合成纤维细胞特征，可以确定为血管外膜成纤维细胞。细胞生长状况良好。经3次传代后，细胞可以达到足够纯度用于进一步实验。 结论:应用大鼠胸主动脉外膜组织块贴块法成功获得血管外膜成纤维细胞。经3次传代后，细胞可以达到足够纯度用于进一步实验。 第二部分 NOX4表达在血管外膜成纤维细胞表型转化中的作用 目的:因为NOX4在心血管系统中存在重要的作用，所以在本部分中我们以NOX4为靶点，探索其在血管外膜成纤维细胞表型转化过程中的作用。 方法:取4-8代处于生长对数期的AF，无血清培养基同步化12h后分别构建空白组细胞，TGFβ1组细胞和TGFβ1+siRNA组细胞。空白组细胞:以含2％胎牛血清的高糖DMEM培养基培养24h; TGF31组细胞:以含2％胎牛血清的高糖DMEM培养基+ TGfβ1 10ng/ml培养24h; TGFβ1 +siRNA组细胞:应用Lipo 2000成功转染NOX4 siRNA后，以含2％胎牛血清的高糖DMEM培养基+TGFβ1 10ng/ml培养24h;免疫荧光法初步检测NOX4表达变化;Western blotting，PCR检测NOX4和α-SMA表达情况;Transwell检测12h，24h的细胞迁移情况。 结果:(1)TGFβ1组与空白组相比，细胞内NOX4的表达明显增加（Western blotting:0.796±0.0616比0.531±0.0444,P＜0.05; PCR:0.7293±0.05280比0.2470±0.01659,P＜0.05）。应用NOX4 siRNA后，NOX4的表达明显减弱（Western blotting:0.420±0.0279比0.796±0.0616，P＜0.05; PCR: 0.2081±0.02166比0.7293±0.05280，P＜0.05)。(2)空白组无α-SMA表达，TGFβ1组α-SMA表达增加，转染NOX4 siRNA后细胞内α-SMA表达明显较TGF β 1组减少（Western blotting:0.3647±0.06642比0.6352±0.09138,P＜0.05; PCR: 0.3375±0.04136比0.5400±0.03158,P＜0.05）。(3)TGFβ1组细胞迁移较空白组明显增强（12h: 20.600±1.5166比3.800±0.8367，P＜0.05; 24h∶ 50.800±2.5884比11.400±1.3416，P＜0.05），转染NOX4 siRNA后细胞迁移受到抑制(12h∶ 7.000±0.7071 比 20.600±1.5166，P＜0.05;24h∶20.400±1.8166比50.800±2.5884, P＜0.05)。 结论:(1)AF表型转化过程中NOX4表达明显增加，细胞迁移明显增强。(2)抑制NOX4活性后，AF表型转化过程受到抑制，细胞迁移减弱。 第三部分 NOX4调节血管外膜成纤维细胞表型转化的相关机制 目的:我们已经在上部分的实验中确定NOX4在AF表型转化过程中存在重要作用。在本部分中，我们进一步探索NOX4调节血管外膜成纤维细胞表型转化的相关机制。 方法:取4-8代处于生长对数期的AF，无血清培养基同步化12h。ROS抑制剂NAC，MEK抑制剂U0126预处理AF后，观察其对TGFβ1诱导的AF表型转化过程中α-SMA表达的影响，并检测下游信号蛋白MEK1/2，ERK1/2的磷酸化水平。 结果:(1) NAC预处理细胞后，AF表型转化受到明显抑制(Western blotting∶0.2332±0.01294 比 0.4700±0.06351， P＜0.05; PCR∶ 0.1959±0.01940 比0.4642±0.03505，P＜0.05），MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平明显降低(p-MEK1/2∶0.4342±0.02450 比 0.6748±0.03225，P＜0.05) (p-ERK1/2∶2.2359±0.1069 比4.9034±0.35521，P＜0.05)。(2) U0126预处理细胞后，AF表型转化受到明显抑制(Western blotting∶ 0.2337±0.01166 比 0.4334±0.05675, P＜0.05; PCR∶0.1468±0.02986比0.3968±0.06183，P＜0.05），ERK1/2的磷酸化水平显著降低(2.9315±0.41269比7.0608±0.45744，P＜0.05)。 结论:(1)抑制ROS活性可以抑制AF发生表型转化，降低细胞内MEK-ERK通路的磷酸化水平。(2)阻断MEK-ERK通路可以抑制AF发生表型转化。(3)NOX4通过调控ROS-MEK-ERK通路调节AF表型转化。

目录

声明

摘要

引言

第一部分大鼠胸主动脉血管外膜成纤维细胞培养

1材料和方法

2原代细胞培养结果

3讨论

4结论

附图

第二部分NOX4在血管外膜成纤维细胞表型转化过程中的作用

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

附表

附图

第三部分NOX4调节血管外膜成纤维细胞表型转化的相关机制

一、材料

二、抑制ROS活性对血管外膜成纤维细胞表型转化的影响及机制

三、抑制MEK活性对血管外膜成纤维细胞表型转化的影响及机制

四、统计分析

五、结果

六、讨论

七、结论

附表

附图

全文总结

参考文献

综述一冠状动脉术后再狭窄研究进展

综述二NOX家族研究进展

攻读博士学位期间科研成果

致谢