人副流感病毒3型核心蛋白与磷酸蛋白相互作用对病毒复制和包涵体形成的影响

摘要

人副流感病毒3型(Human Parainfluenza Virus Type3，HPIV3)是引起婴幼儿急性下呼吸道疾病如支气管炎、肺炎等的主要病原之一。它与人们所熟知的呼吸道合胞病毒、狂犬病毒、麻疹病毒等一样，都属于不分节负链RNA病毒。目前，对于HPIV3还没有有效的抗病毒药物和疫苗。因此，澄清HPIV3的复制转录的机制将为下一步研制有效的抗病毒药物和疫苗提供理论和实验基础。 病毒的核心蛋白(Nucleoprotein，N)包裹病毒的基因组形成N-RNA模板，磷酸蛋白(Phosphoprotein，P)则是病毒RNA聚合酶辅因子。它们与聚合酶的大蛋白（Large protein，L）一起组成病毒RNA聚合酶复合体，在病毒转录复制过程中起着非常重要的作用，也因此N蛋白和P蛋白之间的相互作用一直是HPIV3的复制转录机制研究的热点。而之前的研究表明，N蛋白氨基端的氨基酸是它完成白身寡聚化以及与RNA结合形成N-RNA模板的关键区域，而它的羧基端则是N-RNA模板与P蛋白结合的关键区域。通过对P蛋白的序列及结构分析，它与N0形式的N蛋白相互作用的区域位于P蛋白氨基端的40个氨基酸内，与N-RNA相互作用的区域位于其羧基端的20个氨基酸内。 尽管近几年对N蛋白与P蛋白相互作用的研究已经很多了，也得到了很多与复制转录机制有关的研究结果，但关于它们之间的相互作用仍有很多问题有待进一步的研究和确认，例如N蛋白上和P蛋白的相互作用的具体位点，N0与P蛋白、N-RNA与P蛋白相互作用的联系和区别等。为了寻找N蛋白上调节N蛋白和P蛋白的相互作用的具体位点，并进一步弄清楚N蛋白与P蛋白相互作用的具体机制，利用HPIV3的微基因组系统，发现了N蛋白上的一个关键氨基酸Leu478，这个氨基酸位点的丙氨酸扫描突变体(NL478A)丧失了RNA合成的能力，并通过免疫共沉淀的方法，证明了这个位点的氨基酸突变丧失了与P蛋白相互作用的能力。为了进一步的区分N0与P蛋白、N-RNA与P蛋白相互作用的差异，利用经CsCl密度梯度离心纯化的N-RNA与P蛋白及其突变体在体外进行免疫共沉淀实验，发现这个位点的氨基酸突变体只是丧失了N-RNA与P蛋白的相互作用的能力，对于N0-P的相互作用则没有影响。同时，检测它们在细胞内的定位情况，发现野生型N蛋白与P蛋白可以形成病毒转录和复制的中心---包涵体，而N蛋白突变体则不能。随后，将这个突变引入到病毒基因组中利用反向遗传学构建重组病毒，但经过多次重复均不能得到带有NL478A突变的重组病毒。通过野生型N蛋白与P蛋白突变体共定位的研究，发现N0以及N-RNA与P蛋白的相互作用对于包涵体形成都是必不可少的。而且通过P蛋白氨基端缺失突变体与羧基端缺失突变体在包涵体及RNA合成方面的互补研究发现P蛋白是一个多功能的蛋白，它存在多个不同的结构域调控N蛋白和P蛋白的相互作用，并调节包涵体的形成。 我们的研究首次对副粘RNA病毒N蛋白和P蛋白的相互作用的位点以及包涵体形成区域进行了精确定位，为抗病毒研究药物和疫苗的研发提供了新的理论和实验依据，对其它负链RNA病毒N蛋白和P蛋白功能研究也具有一定的启示意义。

目录

声明

常用缩写

摘要

第一章前言

1人副流感病毒概述

1．1人副流感病毒的发现及其分类

1．2人副流感病毒3型的流行病学

1．3人副流感病毒3型的形态结构

2 HPIV3的生物学特性

2．1 HPIV3的基因结构

2．2 HPIV3各蛋白简介

2．3 HPIV3的生活史

2．4负链RNA病毒的反向遗传学

2．5 HPIV3的微基因检测

3 N蛋白与P蛋白相互作用的研究

3．1 N蛋白与P蛋白结构、功能的介绍

3．2 N-P相互作用与病毒的转录和复制

3．3 N蛋白与P蛋白相互作用研究现状

4病毒包涵体的研究

第二章实验材料与方法

1实验材料

1．1菌种和细胞

1．2主要的酶系统及试剂

2实验方法

2．1表达载体的构建

2．2细胞培养及转染

2．3 HPIV3微基因组的检测分析

2．4蛋白免疫印迹(Western blot)分析

2．5细胞裂解液和细胞沉淀的检测

2．6体内免疫共沉淀

2．7 CsCl超速离心纯化N-RNA

2．8苯酚-氯仿-异戊醇抽提RNA

2．9体外免疫共沉淀

2．10 T7 RNA体外转录

2．11间接免疫荧光

2．12重组HPIV3病毒

2．13噬斑纯化

2．14病毒滴度测定

2．15细胞总RNA抽提

2．16逆转录-PCR

第三章结果与讨论

1 N蛋白和P蛋白相互作用的研究

1．1 N蛋白羧基21-40区域内的氨基酸对于N-P相互作用非常关键

1．2 NL478是N蛋白和P蛋白的相互作用的关键位点

1．3 Leu 478是一个对转录活性非常关键的氨基酸位点

1．4 NL478A丧失了NL478A-RNA与P蛋白的相互作用，保持着NL478A0和P蛋白的相互作用

2 N蛋白和P蛋白形成包涵体的研究

2．1 N蛋白和P蛋白共转染可以形成包涵体

2．2包涵体结构中含有病毒转录和复制的所有组分

3野生型N蛋白可以弥补NL478A功能的缺失

3．1野生型N蛋白可以弥补NL478A在微基因组转录功能方面的缺失

3．2野生型N蛋白可以弥补NL478A在包涵体形成方面的缺失

4 NL478A突变体丧失了得到重组病毒的能力

5包涵体形成条件的探究

5．1 P蛋白存在多个区域调节N蛋白和P蛋白的相互作用

5．2 P蛋白羧基端的100个氨基酸是维持N-RNA-P相互作用的最小区域

5．3 P N40可以互补PΔN40功能的缺失

5．4包涵体的形成是一个逐渐变大的动态过程

5．5 P蛋白氨基端更长的区域可互补PΔN40转录活性的丧失

6讨论

第四章总结与展望

1总结

2展望

参考文献

博士期间发表文章

致谢