小鼠腹主动脉瘤与内皮型一氧化氮合酶解偶联的关系

摘要

腹主动脉瘤（AAA）是指腹主动脉永久不可逆性呈瘤样扩张，直径增大50％以上。近些年随着人口老龄化，AAA的发病率呈增长趋势，且因其破裂后死亡率高，严重威胁患者生命而成为急需解决的医学问题。对AAA机制研究过去主要集中在细胞外基质、平滑肌细胞等主动脉壁中膜，现在越来越多证据表明血管内皮细胞在AAA形成中也起着重要作用。内皮细胞功能与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)偶联状态密切相关。当eNOS解偶联成为单体时，主要催化生成超氧阴离子，一氧化氮(NO)产生减少同时灭活增加，导致内皮功能障碍。四氢生物碟呤(BH4)是eNOS必要辅助因子，eNOS偶联状态受BH4的调节，而三磷酸鸟苷环化水解酶1型(GTPCH-1)和二氢叶酸还原酶(DHFR)分别是四氢生物碟呤(BH4)从头合成及补救合成途径的限速酶酶。本研究旨在建立腹主动脉瘤模型基础上，探讨腹主动脉壁内皮细胞中eNOS表达，偶联状态，调节偶联状态的限速酶GTPCH1/DHFR等在AAA发生中作用，这将有助于理解eNOS偶联状态在AAA主动脉壁中作用，为内科药物防治寻找有效措施。 第一部分：血管紧张素Ⅱ联合延胡索酸-3-氨基丙腈诱导小鼠AAA模型的建立及评估 目的:建立腹主动脉瘤模型，为后续探讨eNOS与腹主动脉瘤的关系提供研究平台。 方法:将30只8周龄SPF级雄性C57小鼠随机分为正常对照组、模型A组、模型B组，每组10只。采用两种方法建立腹主动脉模型，模型A组小鼠皮下植入微量渗透泵持续泵入血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)28天，剂量为1μg/kg/min，用含0.25％延胡索酸-3-氨基丙腈(BAPN)饲料饲喂28天。模型B组小鼠使用含0.25％BAPN饲料饲喂28天，第27天皮下泵入AngⅡ48h，空白对照组使用普通饲料。所有小鼠取材后，统计小鼠AAA发生率，测量小鼠腹主动脉直径，石蜡切片进行间苯二酚碱性品红弹性纤维染色，免疫组化染色检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达。 结果:1.两种方法均能建立腹主动脉瘤模型，模型A组小鼠AAA发生率为70％，模型B组小鼠AAA发生率为22.2％(P＜0.05)。2.模型A组腹主动脉直径较空白对照组明显增加{（2.44±0.32）mm vs.（1.01±0.08）mm，P＜0.01}，模型A组腹主动脉直径大于模型B组{（2.44±0.32）mm vs.（1.45±0.23）mm，P＜0.05}，模型B组直径与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。3.弹性纤维染色显示模型A组和B组与对照组比较弹性纤维均有断裂及排列紊乱。4.免疫组化染色显示模型A组和B组比对照组MMP-2表达增多（P＜0.05）。 结论:AngⅡ持续皮下泵入联合BAPN两种方法均可诱导成功建立小鼠AAA模型，且A方法优于B方法。 第二部分：eNOS偶联状态在AAA形成中的作用 目的:探讨eNOS是否通过影响血管内皮功能进而对AAA的形成产生影响。 方法:30只8周龄SPF级雄性C57小鼠随机分为正常对照组和模型组，建模方法同第一部分模型A组。所有小鼠取腹主动脉组织及血清，用硝酸还原酶法检测各组血清内NO水平;用DHE原位荧光探针法检测各组主动脉超氧阴离子自由基(O2-)的水平;超高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测血清中BH4含量;Western blot和RT-PCR分别检测各组主动脉DHFR及GTPCH-1蛋白以及mRNA的表达情况。 结果:1.与正常对照组比较，模型组小鼠血清中NO表达降低(P＜0.05)。2.与正常对照组比较，模型组小鼠血清中BH4水平下降(P＜0.05)。3.DHE染色结果显示，模型组比正常对照组小鼠主动脉壁内O2-水平显著升高。4.Western blot结果显示，模型组比正常对照组小鼠主动脉内eNOS、GTPCH1和DHFR蛋白表达明显降低(P＜0.05)，RT-PCR结果显示模型组小鼠主动脉内eNOS、GTPCH1和DHFR表达明显降低（P＜0.05）。 结论:动脉血管壁的内皮细胞中GTPCH-1及DHFR表达降低引起BH4水平下降，进而eNOS解偶联，eNOS表达进一步降低，最终造成内皮功能紊乱促进了AAA发生。

目录

声明

摘要

引言

第一部分血管紧张素II 联合胡索酸-3-氨基丙腈诱导小鼠腹主动脉瘤模型的建立及评估

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

第二部分eNOS 偶联状态在AAA形成中的作用

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

综述内皮功能与腹主动脉瘤发病机制的研究进展

攻读硕士期间发表的论文

致谢