医用臭氧抑制腰椎间盘突出症中异常自身免疫应答的实验研究

摘要

臭氧（Ozone,O3）由三个氧原子组成，是氧分子（Oxygen,O2）的同素异形体。作为已知可利用的最强的氧化剂之一，其氧化能力在自然界仅次于氟。医用臭氧（Oxygen-Ozone,O3-O2）是以医用纯氧为原料制成的臭氧和氧气的混合物，可在气相条件下或溶解于水中发挥作用，其有效成分是臭氧。近十几年来，西欧一些国家采用椎间盘内和椎旁间隙注射医用臭氧的方法治疗腰椎间盘突出症取得良好的疗效，国内多家医疗单位也开展了此项技术。关于腰椎间盘突出症的发病机制，目前多数学者都倾向于髓核引发的自身免疫学说，但关于该学说在动物模型上的验证还不够充分和详实；同时对于医用臭氧注射对腰椎间盘突出症中异常自身免疫应答的影响还欠缺相关的动物实验研究。 目的：在大鼠身上建立非机械压迫性腰椎间盘突出症模型，以医用纯氧为阴性对照，运用行为学、组织病理学评价医用臭氧对该模型的影响，并运用透射比浊法、间接ELISA法、免疫组织化学染色以及MTT法观察医用臭氧对该模型中外周血免疫球蛋白IgG和IgM、抗髓核自身抗体、局部抗原抗体复合物以及特异性T淋巴细胞增殖能力的影响作用，从而探讨医用臭氧对腰椎间盘突出症中自身免疫应答的影响。 方法： 1.分组和模型建立：将50只SD大鼠随机分为五组，每组10只。A组正常对照组：切除鼠尾，行L4～L5间隙硬膜外穿刺，分别注射0.5ml生理盐水注射液和2％利多卡因注射液30μl；B组（模型对照组），C组（医用臭氧组），D组（医用纯氧组）：均按非机械压迫性腰椎间盘突出症模型建立方法造模[1]。E组(抗原制备组）:暂不作处理，常规饲养。 2.第二次穿刺并注射干预：于模型建立后第14天分组处理：A组及B组:行L4/5硬膜外穿刺，分别注射0.5ml生理盐水注射液和2％利多卡因注射液30μl；C组：行L4/5硬膜外穿刺，分别注射0.5ml医用臭氧气体（浓度为30 μg/ml）和2％利多卡因注射液30μl；D组：行L4/5硬膜外穿刺，分别注射0.5ml医用纯氧气体和2％利多卡因注射液30μl；E组:暂不做处理，常规饲养。 3.模型建立前一天,模型建立后的一周，两周（注射干预前），注射干预后一周（处死前）分别对A、B、C、D组大鼠进行爬坡试验测定；模型建立前一天，模型建立后的第3，6，9，12天，注射干预后第1天，4天，7天（处死前）分别对A、B、C、D组大鼠进行后肢机械刺激缩爪阈值测定。 4.第二次穿刺并注射干预后第7天将E组大鼠尾椎髓核取出利用匀浆后离心取上清的方法得到髓核蛋白抗原，将A、B、C、D组大鼠取外周血检测免疫球蛋白总IgG,IgM含量，间接ELISA法检测外周血抗髓核自身抗体含量，取出L4,L5神经根作光镜观察（HE染色），取出L4,5段椎管内组织作免疫组化染色观察抗原抗体复合物的沉积，MTT法检测特异性T淋巴细胞增殖功能。 结果： 1.模型建立后第14天（第二次穿刺及注射干预前）模型对照组，医用臭氧组及医用纯氧组大鼠表现出活动频繁、易激惹的现象，爬坡试验为Ⅲ级，后肢出现较明显的痛觉过敏（P<0.01），模型建立成功。 2.第二次穿刺及注射干预后第7天，模型对照组及医用纯氧组仍然表现出活动频繁、易激惹的现象，爬坡试验为Ⅲ级，后肢机械缩爪阈值较正常组及注射干预前显著降低（P<0.01）；医用臭氧组有两只大鼠仍然表现出活动频繁、易激惹的现象，其余大鼠活动情况较注射干预前明显好转，爬坡试验有两只为Ⅲ级，其余为Ⅳ级，后肢机械缩爪阈值较模型组及注射干预前有明显增高（P>0.01）。 3.模型对照组与正常组相比，总IgG，IgM含量升高（P<0.05）；医用臭氧组与模型对照组相比，其外周血总IgG，IgM含量有统计学意义的降低（P<0.05）,与医用纯氧组相比有统计学差异（P<0.05）。 4.和正常组相比，模型对照组大鼠外周血针对髓核蛋白抗原的自身抗体含量升高（P<0.01）；医用臭氧组的自身抗体水平较模型对照组有所降低（P<0.05），与医用纯氧组相比有统计学差异（P<0.05）。 5.造模后，模型对照组和医用纯氧组大鼠L4,L5神经根出现炎性反应，有不同程度的神经损害;医用臭氧组神经根炎性反应较模型对照组明显减轻，正常细胞较模型对照组多。 6.正常对照组大鼠髓核中无抗原抗体复合物阳性沉积，模型对照组7只大鼠有抗原抗体复合物存在，阳性率为70％，与正常对照组相比有统计学意义（P<0.01）；医用臭氧组两只大鼠有抗原抗体复合物存在，阳性率为20％，阳性率小于模型对照组（P<0.05）；医用纯氧组6只大鼠有抗原抗体复合物存在，阳性率为60％，阳性率与模型对照组相比无统计学意义（P>0.05）。 7.和正常组相比，模型对照组大鼠特异性T淋巴细胞增殖能力升高（P<0.05）；医用臭氧组和模型对照组相比其特异性T淋巴细胞增殖能力降低（P<0.05），与医用纯氧组相比有统计学差异（P<0.05）。 结论： 1.本实验在大鼠身上建立非机械压迫性腰椎间盘突出症模型，建模后动物出现活动频繁易激惹的异常情况，后肢出现肌力下降及明显的痛觉过敏，神经根有较明显的炎性反应，模型建立成功。 2.本实验通过自身免疫相关指标检测，证实该动物模型中存在异常的自身免疫应答，表现在细胞免疫和体液免疫两方面，以体液免疫异常为主。 3.本实验采用医用臭氧注射对该模型进行干预，证实医用臭氧注射后可以改善腰椎间盘突出症动物异常行为，提高后肢肌力，缓解痛觉过敏，减轻神经根炎性反应；通过免疫指标检测证实医用臭氧注射可以在一定程度上抑制腰椎间盘突出症动物中异常的自身免疫应答，为医用臭氧在临床上更加广泛地应用和发展提供了有力的实验证据。