PD-L1高表达的间质细胞通过诱导免疫耐受促进肿瘤生长的实验研究

摘要

目的：前期的实验研究证明一定量的化疗药物,如顺铂处理肿瘤细胞之后,肿瘤细胞上 PD-L1的表达水平增高,这也是顺铂对于恶性肿瘤的治疗预后不好的原因之一。顺铂是不是也可以诱导肿瘤微环境中纤维细胞、血管内皮细胞等的PD-L1的表达量上升导致肿瘤微环境的免疫耐受,使恶性肿瘤继续发生、发展?本研究通过基因工程技术构建表达 mPDLl真核表达载体,在 L929细胞中稳定高表达,通过PD-L1转基因细胞的构建及其功能的研究进一步探讨PD-L1信号发挥作用的分子机制及其与肿瘤发生的关系。
　　方法：(1)不同浓度的化疗药物 DDP处理L929细胞,流式细胞技术检测 PD-L1在 L929细胞上表达水平;(2)PCR方法扩增得到小鼠的PD-L1全长片段,以pcDNA3.1(+)真核表达质粒为载体,构建得到重组质粒 pcDNA3.1(+)-PD-L1。脂质体转染法将重组质粒转染到小鼠成纤维细胞(L929),通过 G418筛选得到高表达PD-L1的稳定细胞株并经逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、细胞免疫荧光、流式细胞术鉴定。用丝裂霉素处理过的PD-L1高表达细胞与小鼠脾淋巴细胞共培养,流式细胞术检测 PD-L1对淋巴细胞增殖作用的影响。(3)动物实验分组:实验组(混合接种了B16细胞和L929-pcDNA3.1(+)-PDL1细胞的小鼠)、对照组1(单独接种 B16细胞)、对照组2(混合接种 B16细胞和L929-pcDNA3.1(+)细胞)、对照组3(混合接种灭活 B16细胞和L929-pcDNA3.1(+)-PDL1细胞)。按实验分组将细胞混合腋下接种昆明小鼠,在动物水平观察间质细胞中PD-L1表达水平的改变对肿瘤生长及转移的影响并测定免疫学指标。
　　结果：(1)分别以2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml DDP刺激 L929细胞之后,L929细胞上的PD-L1的表达水平增高。但以更低剂量的DDP刺激 L929细胞之后无PD-L1表达水平的改变。(2)PCR方法获得小鼠PD-L1全长基因,通过 EcoRI/XhoI双酶切及测序证实构建的重组质粒 pcDNA3.1(+)-PD-L1正确;转染细胞经 G418筛选后获得稳定表达 mPD-L1的L929细胞株:RT-PCR显示转染 pcDNA3.1(+)-PDL1质粒的L929细胞出现约900bp条带(mPD-L1 mRNA的表达),对照组无目的条带出现;荧光显微镜下观察转染 pcDNA3.1(+)-PDL1质粒的L929细胞可见红色荧光,表明有 PD-L1蛋白的表达,阴性对照细胞(转染 pcDNA3.1(+)质粒的L929细胞)未见红色荧光;流式细胞术鉴定转染空载 pcDNA3.1(+)的L929细胞相比,转染pcDNA3.1(+)-PD-L1的细胞的荧光值明显增高,确定重组质粒在 L929细胞中高效表达。(3)PD-L1抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖。(4)小鼠的肿瘤生长率实验组较对照组快;实验组小鼠血清使鸡血红细胞溶血率显著降低,间接反映小鼠机体免疫能力较对照组小鼠降低了;实验组小鼠脾脏 NK细胞对 B16细胞的杀伤活性较对照组降低;实验组小鼠淋巴细胞增殖能力较对照组减弱。
　　结论：(1)低剂量 DDP刺激 L929细胞可以上调其 PD-L1表达量;(2)成功构建真核表达质粒 pcDNA3.1(+)-PD-L1;(3)建立稳定表达 mPD-L1的L929细胞株L929-pcDNA3.1(+)-PDL1且有生物学活性;(4)动物实验证实间质细胞中PD-L1高表达形成的免疫耐受微环境可加速肿瘤细胞生长。

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英文缩略词表

引 言

材料与方法

1.1 仪器和材料

1.2 实验方法

结果

第一部分 DDP 诱导 L929 细胞 PD-L1 的表达

第二部分 小鼠 PD-L1 真核表达载体的构建

2.1 PCR 扩增鼠 PD-L1 全长 DNA 片段

2.2 阳性重组子的酶切、筛选与鉴定

第三部分 稳定表达小鼠 PD-L1 基因细胞株的筛选及鉴定

3.1 RT-PCR 检测 mPD-L1 在 L929 细胞中的表达

3.2 免疫荧光检测 mPD-L1 在 L929 细胞上的表达

3.3 流式细胞术检测 mPD-L1 在 L929 细胞中的表达

3.4 PD-L1 高表达细胞对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

第四部分 PD-L1 高表达细胞促进肿瘤生长的体内实验

4.1 小鼠荷瘤状况

4.2 小鼠荷瘤后的肿瘤生长率及瘤重

4.3 机体免疫功能测定

4.4 小鼠 NK 细胞杀伤 B16 细胞活性

4.5 MTT 法测小鼠特异性淋巴细胞增殖

4.7 小鼠黑色素瘤组织免疫组化

讨论

小结

参考文献

综 述

后 记

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论文

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著（黑体 3 号）