TLR4通过活化NF-κB途径对调节性T细胞的抑制功能起作用

摘要

目的:天然调节性T细胞(nTregs,即CD4+CD25+Tregs)是具有显著免疫抑制功能的T细胞,不同种类的TLR活化后对其具有不同的作用。为此,体外研究nTregs上膜型TLR4与不同配体结合后分泌细胞因子的变化及其对该细胞抑制功能的影响,初步探讨在不同微环境中TLR4影响nTregs功能的机制。
　　方法:(1)采用磁珠分选出健康人外周血的CD4+CD25+Tregs,并用流式细胞术检测分选的纯度。(2)实验分为两组,正常CD4+CD25+Tregs(即Non anti-TLR4组)和经抗TLR4单抗封闭的CD4+CD25+Tregs(即anti-TLR4组),两组细胞分别加入高、中、低不同浓度的LPS(10、1、0.1μg/ml)、HMGB1(1、0.1、0.01μg/ml)刺激培养,同时分别设不加LPS或HMGB1作为对照。采用实时定量PCR检测各组中IL-1β、IL-10、IFN-γ、TGF-β四种细胞因子的RNA表达水平,同时用ELISA检测细胞培养上清中上述四种细胞因子的含量。(3)流式细胞术检测经过1μg/ml及10μg/ml LPS、0.1μg/ml及1μg/ml HMGB1不同处理的两组CD4+CD25+Tregs与CD4+T效应细胞混合培养后CD4+T细胞的增殖水平。(4)Western-blotting检测经过1μg/ml LPS及1μg/ml HMGB1刺激后两组CD4+CD25+Tregs的胞浆及胞核蛋白中NF-κB的表达水平。
　　结果:(1)流式细胞术检测分选得到的CD4+CD25+Tregs纯度>82％(84.52±2.10%)(2)HMGB1刺激的CD4+CD25+Tregs在Non anti-TLR4组中IL-1β、IL-10及TGF-β的RNA水平及蛋白含量均较无HMGB1刺激的对照组明显降低(P<0.05),而anti-TLR4组中较相应对照组显著增高(P<0.05);IFN-γ的RNA水平及蛋白含量变化趋势与之相反,在Non anti-TLR4组中较对照组增加(P<0.05),而在anti-TLR4组中明显低于相应对照组(P<0.05)。LPS刺激的CD4+CD25+Tregs在Non anti-TLR4组中IL-1β及IL-10的RNA表达水平和蛋白含量均较无LPS刺激的对照组显著增加(P<0.05),而在anti-TLR4组中明显低于相应对照组(P<0.05);IFN-γ及TGF-β在Non anti-TLR4组中RNA表达水平和蛋白含量均较对照组显著降低(P<0.05),而在anti-TLR4组中仅IFN-γ的RNA水平与TGF-β明显高于相应对照组(P<0.05),IFN-γ的蛋白含量仍低于对照组(P<0.05)。(3)CD4+CD25+Tregs显著抑制CD4+T细胞的增殖,与CD3/CD28抗体活化的阳性对照组相比有差异(P<0.05)。经HMGB1刺激的Non anti-TLR4组中,CD4+T细胞增殖指数较无HMGB1刺激的对照组略微增高(P<0.05);anti-TLR4组中,CD4+T细胞增殖指数较无HMGB1刺激的相应对照组明显降低(P<0.05)。然而,经LPS刺激的Non anti-TLR4组中,CD4+T细胞增殖指数较无LPS刺激的对照组明显降低(P<0.05);anti-TLR4组中,CD4+T细胞增殖指数较相应对照组显著增加(P<0.05),较阳性对照组亦明显增加(P<0.05)。(4)Western-blotting结果显示:用1μg/ml HMGB1和LPS分别刺激两组CD4+CD25+Tregs后,Non anti-TLR4组胞浆蛋白中NF-κBp65的含量较无刺激对照组降低,而胞核中则相应增加;anti-TLR4组则无明显改变。
　　结论:在不同微环境中,CD4+CD25+Tregs表面的膜型TLR4具有不同的作用,继而对CD4+CD25+Tregs的抑制功能进行调节。当经TLR4的内源性配体HMGB1活化时, CD4+CD25+Tregs以分泌促炎性细胞因子IFN-γ为主,其抑制功能减弱;当与外源性配体LPS相互作用时,IL-1β和IL-10的含量同时增多,其抑制功能增强;二者均与NF-κB信号分子的活化相关。综上诉述,TLR4通过活化NF-κB途径对调节性T细胞的抑制功能起作用。

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英文缩略词表

引言

材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1血液样本

1.1.2细胞

1.1.3细胞因子

1.1.4培养基

1.1.5抗体与磁珠

1.1.6其他所需试剂

1.1.7相关材料

1.1.8仪器设备

1.2实验方法

1.2.1 CD4+CD25+Tregs的分离与培养

1.2.2分选纯度的检测

1.2.3 ELISA检测上清中各种细胞因子的含量

1.2.4 QRT-PCR检测以上各分组中各种细胞因子的表达

1.2.5 CFSE检测各组CD4+CD25+Tregs与CD4+T效应细胞混培后的增殖情况

1.2.6 Western-blotting 检测 CD4+CD25+Tregs 细胞表面的 TLR4 活化后NF-κB的表达变化

结果

第一部分 流式细胞术检测经磁珠分选得到的CD4+CD25+Tregs纯度＞82%。

第二部分 HMGB1刺激CD4+CD25+Tregs分泌细胞因子IFN-γ，抑制IL-1β、IL-10和TGF-β的分泌。

第三部分 LPS促进CD4+CD25+Tregs分泌细胞因子IL-1β和IL-10，抑制IFN-γ和TGF-β的分泌。

第四部分 HMGB1使CD4+CD25+Tregs抑制CD4+T细胞增殖的能力减弱，而LPS使CD4+CD25+Tregs抑制能力增强。

第五部分 HMGB1、LPS均通过NF-κB的活化调节CD4+CD25+Tregs的功能

讨论

小结

参考文献

综述

后记

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著