RP105抑制TLR4信号通路对大鼠心肌缺血再灌注凋亡损伤的保护作用及其机制研究

摘要

目的：探讨RP105心肌过表达对TLR4信号通路介导的心肌缺血再灌注凋亡损伤的保护作用，并探讨其分子机制。
　　方法：将40只SPF级雄性SD大鼠(220-250g)随机分为4组(n=10)：生理盐水+假手术组(Sham组)、生理盐水+缺血再灌注组(I/R组)、Ad-EGFP+缺血再灌注组(Ad-E组)、Ad-EGFP-RP105+缺血再灌注组(Ad-E-R组)。采用多点注射法，将重组腺病毒载体或生理盐水在体转染大鼠心肌，转染后3天构建心肌缺血再灌注损伤模型。缺血30min再灌注4h后空气栓塞法处死大鼠，采用免疫荧光及Real-time PCR法检测转染基因EGFP、RP105表达；Evans blue+TTC双染法检测大鼠心肌梗死面积；TUNEL法检测大鼠心肌凋亡指数；Western blot检测线粒体相关的凋亡级联反应Bax、cytochrome c、Bcl-2、caspase-9、cleaved caspase-3表达情况以及RP105、TLR4、P38MAPK、p-P38MAPK、c-Jun/AP-1、p-c-Jun/AP-1蛋白表达。
　　结果：(1)重组腺病毒载体Ad-EGFP、Ad-EGFP-RP105转染心肌组织3天后，转染基因EGFP与RP105在心肌成功过表达。(2)与Sham组相比，I/R组、Ad-E组、Ad-E-R组心梗面积、心肌凋亡指数均显著增加(p<0.05)；线粒体依赖性凋亡级联反应中促凋亡分子Bax、Cyt-c、caspase-9、cleaved caspase-3表达均明显增加(p<0.05)，而抗凋亡分子Bcl-2表达明显降低(p<0.05)；TLR4信号通路中TLR4、P38MAPK、p-P38MAPK、c-Jun/AP-1、p-c-Jun/AP-1蛋白表达水平均显著增加(p<0.05)。(3)与I/R组、Ad-E组相比， Ad-E-R组心梗面积、心肌凋亡指数显著降低(p<0.05)；线粒体依赖性凋亡级联反应中促凋亡分子表达明显降低，而抗凋亡分子表达显著升高；TLR信号通路中TLR4、p-P38MAPK、p-c-Jun/AP-1蛋白表达均明显降低(p<0.05)。(4) I/R组、Ad-E组两组间心梗面积、心肌凋亡指数、线粒体依赖性凋亡级联反应中促凋亡分子、抗凋亡分子表达水平以及TLR4信号通路中TLR4、P38MAPK、p-P38MAPK、c-Jun/AP-1、p-c-Jun/AP-1蛋白表达水平均无统计学差异(p>0.05)。(5) I/R组、Ad-E组、Ad-E-R组三组间P38MAPK及c-Jun/AP-1蛋白表达无统计学差异(p>0.05)。此外，p-P38/P38MAPK、p-c-Jun/c-Jun相对表达率比值结果表明：与Sham组比较，I/R组、Ad-E组、Ad-E-R组比值明显升高(p<0.05);与I/R组、Ad-E组相比，Ad-E-R组比值显著降低(p<0.05)；I/R组、Ad-E组比值升高程度无显著性差异(p>0.05)。
　　结论：(1) Ad-EGFP及Ad-EGFP-RP105重组腺病毒成功转染心肌组织，可显著提高转染基因EGFP、RP105mRNA与蛋白表达；(2) RP105心肌过表达可显著降低缺血再灌注心肌损伤，降低再灌注心肌细胞凋亡；(3)心肌缺血再灌注中TLR4信号通路激活，促进下游信号分子P38MAPK及转录因子c-Jun/AP-1磷酸化活化，从而参与缺血再灌注心肌细胞的凋亡损伤过程；(4) RP105心肌过表达可抑制线粒体依赖性的凋亡级联反应，降低缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡；(5) RP105可能通过抑制TLR4/P38MAPK/AP-1信号通路活化，从而抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤。

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英文缩略词表

引言

材料与方法

1.1 试剂和设备

1.2 实验方法

结果

第一部分 成功构建大鼠心肌I/R损伤模型

第二部分 重组腺病毒转染基因在心肌细胞成功表达

第三部分 重组腺病毒转染心肌组织后RP105蛋白及mRNA表达水平

第四部分 Evans blue+TTC双染法测定大鼠心肌梗死面积

第五部分 TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡指数

第六部分 RP105对线粒体依赖性凋亡级联反应相关分子表达影响

第七部分 RP105对TLR4/P38MAPK/AP-1信号通路表达影响

讨论

小结

参考文献

综述: Beclin1调控自噬、凋亡与炎症反应的分子机制

后记

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著