宜昌市肺炎克雷伯杆菌MLST及其主要流行菌株致病机制的实验研究

摘要

目的：肺炎克雷伯杆菌为医院感染、社区感染的常见条件致病菌。随着细菌耐药性的出现，肺炎克雷伯杆菌感染有着病情难以控制、发展迅速、严重者可引起败血症、脓毒血症、甚至多器官功能衰竭导致患者死亡等特点。作为一种备受关注的院内外感染的常见病原菌，宜昌市肺炎克雷伯杆菌的流行特点及其主要流行菌株致病性的相关研究尚未见报道。鉴于此，分离临床菌株进行基因分型、鉴定主要流行菌株及研究其致病机制对揭示宜昌市肺炎克雷伯杆菌的分子流行病学及其感染特点具有重要意义。
　　材料与方法：在宜昌市肺炎克雷伯杆菌的MLST中，收集2014年11月1日至12月31日来自三峡大学医学院三家附属医院临床分离的肺炎克雷伯杆菌。临床分离培养肺炎克雷伯杆菌后，用多位点序列分型技术（MLST，multilocus sequence types）确定肺炎克雷伯杆菌序列型，同时应用eBURST3.0软件对MLST结果进行肺炎克雷伯杆菌种群结构分析。在主要流行菌株致病机制的实验研究中，将60只健康的C57B6小鼠随机分组，建立皮肤感染模型及肺炎模型，每个感染模型取3个时间点，每个时间点分为1个对照组及1个实验组，每组随机选取5只小鼠。将适量流行菌株菌液注射小鼠右侧腹部皮下组织建立皮肤感染模型，于感染后第1d、5d、10d取皮肤炎症组织，通过HE染色观察组织病理学变化，甲苯胺蓝染色观察肥大细胞的数量与分布及免疫组化检测TNF-α、tryptase在皮肤炎症部位的表达。同时，通过滴鼻建立肺炎克雷伯杆菌肺炎模型，于感染后第1 d、10 d、21 d取肺炎组织，通过HE染色观察肺炎组织病理学变化及免疫组化检测TNF-α、tryptase、p65及NOS1在肺炎组织的表达。
　　结果：在宜昌市肺炎克雷伯杆菌MLST中，通过分离培养，鉴定到30株肺炎克雷伯杆菌。MLST将菌株分为17个ST，其中，ST23为5株，约占17％；ST412及ST753各3株，各占10%；ST60、ST895、ST340、ST392及ST25各2株，约各占7%；ST1049、ST268、ST722、ST173、ST307、ST86、ST65、ST660及ST395各为1株。经eBURST3.0分析将17个ST分为2个克隆群（ST340、ST895；ST65、ST25），1个CC23克隆复合体（ST23、ST25、ST60、ST65、ST86、ST268、ST340、ST395、ST412、ST660、ST722及ST895），其中ST173、ST307、ST392、ST753及ST1049为单个型。在ST23流行菌株致病机制的实验研究中，ST23菌株可诱导皮肤组织的炎症形成，与PBS对照组相比，感染组中炎性介质TNF-α及tryptase表达明显上调，免疫效应细胞肥大细胞数量在炎症区域显著增加，图像分析统计发现与 PBS对照组相比有统计学意义（P<0.05，P<0.01或 P<0.001）；ST23菌株可诱导小鼠肺炎，与PBS对照相比，细菌感染组肺组织有明显的组织病理学损伤与炎症变化，免疫组化染色发现炎症介质TNF-α、NF-κB p65及NOS1在感染组肺组织的表达显著升高，经图像分析统计发现与PBS对照组相比具有统计学意义（P<0.05，P<0.01或 P<0.001）。
　　结论：宜昌市肺炎克雷伯杆菌 MLST呈现基因多态性，其中主要流行菌株的序列型为 ST23。ST23菌株可诱导皮肤及肺脏的感染及炎症损伤，炎性介质 TNF-α、tryptase及肥大细胞可能参与了ST23菌株皮肤感染的发病；炎性介质TNF-α、NF-κB p65及NOS1可能参与了ST23肺炎克雷伯杆菌肺炎的发病。

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引言

第一部分：宜昌市肺炎克雷伯杆菌MLST

1 材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2 实验结果

2.1 1%琼脂糖凝胶电泳

2.2 KP 7个管家基因回收后DNA浓度

2.3 KP MLST分析结果

2.4 ST23菌株7个管家基因测序结果

2.5 eBURST3.0软件构建KP种群进化图

3 讨论

第二部分：ST23菌株致病机制的实验研究

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1实验方法

2 结果

2.1 ST23菌株皮肤感染模型研究结果

2.2 ST23菌株肺炎模型研究结果

3 讨论

4 全文结论

参考文献

综述:肺炎克雷伯杆菌发病机制研究进展

后记

附录：攻读硕士学位期间发表的学术论著