S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶新型共价抑制剂的发现

摘要

目的：以人体细胞普遍存在的多胺合成通路的关键酶S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶为研究对象，并以本课题组已建立的AdoMetDC-PEPC-MDH法为基础，初步筛选出对人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶有抑制力的小分子化合物，再通过高效液相色谱法对初筛有效果的小分子药物进行二轮筛选，同时验证小分子药物与人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶是否通过发生共价结合反应而抑制其活性，以期验证本课题组以AdoMetDC为靶标的抗肿瘤药物高通量筛选方法，并且得到对人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶有较好抑制效果的共价结合的小分子抑制剂。
　　方法：（1）在人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶蛋白洗脱蛋白中添加腐胺（2）利用体外酶促反应，运用AdoMetDC-PEPC-MDH法，以AdoMetDC抑制剂MGBG为阳性药，在340nm波长下检测吸光值，初步筛选出对AdoMetDC有抑制活性的小分子药物。（3）将初步筛选得来的小分子药物以及阳性对照药MGBG通过HPLC方法进行二轮筛选，检测底物S-腺苷甲硫氨酸的剩余量来确定各小分子药物对S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶蛋白是否有抑制能力，并比较出各小分子药物的抑制力强弱。（4）运用质谱法、不同时间孵育法和稀释法对AdoMetDC及小分子抑制剂的结合方式进行验证。
　　结果：（1）优化条件得到了高活性的人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶蛋白。（2）人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶与PEPC-MDH法相耦联的酶促反应实验初步筛选出了27，28，2930，36，37，47，52，53号可能有抑制效果的小分子。（3）利用HPLC法筛选，得到47，52，53号药物对人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶蛋白活性具有抑制效果，且47号药物的抑制效果较显著。（4）对47，52，53号小分子药物与人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶蛋白的结合方式进行探究，47，52，53号药物表现出了很好的共价抑制趋势。
　　结论：本研究利用本课题组建立的一种非放射性的人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶活性检测方法，以及后续的HPLC及质谱法检测方法成功筛选出了有一定抑制作用且与S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶蛋白共价结合的小分子抑制剂。为人S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制药物的高通量筛选提供了一种可行的方法。为以多胺代谢通路为靶标设计抗肿瘤药物的研发提供了新的参考。

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英文缩略词表

引言

材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1仪器及设备

1.1.2药品及试剂

1.1.3质粒及菌株

1.1.4试剂配制

1.2 实验方法

1.2.1AdoMetDC质粒扩增

1.2.2目的蛋白的诱导表达

1.2.3目的蛋白的纯化

1.2.4蛋白浓度的测定

1.2.5分光光度计法筛选小分子化合物

1.2.6高效液相色谱法筛选小分子化合物

1.2.7质谱法测定小分子与蛋白质结合状态

1.2.8不同孵育时间法验证小分子与AdoMetDC共价结合

1.2.9稀释法验证小分子与AdoMetDC共价结合

结果

第一部分 AdoMetDC目的蛋白的表达纯化

第二部分AdoMetDC抑制剂的筛选

2.1 AdoMetDC-PEPC-MDH法筛选电脑高通量筛选的小分子化合物

2.2 高效液相色谱法筛选AdoMetDC小分子抑制剂

第三部分AdoMetDC共价抑制剂的验证

3.1不同孵育时间法验证小分子与AdoMetDC共价结合

3.2稀释法验证小分子与AdoMetDC共价结合

3.3质谱法验证小分子与AdoMetDC共价结合

讨论

结论

参考文献

综述: 亚精胺诱导自噬在衰老相关疾病中的作用

后记

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著