大熊猫非损伤性样品DNA的提取和SSR标记的分离

摘要

大熊猫是世界上著名的濒危物种之一,是中国的国宝,对其保护性研究得到了世界范围的广泛关注.目前,大熊猫所面临的问题主要是:种群数量少、分布狭窄、遗传多样性贫乏、存在较为严重的近亲繁殖和生殖能力差.解决这些问题,制定正确的繁育计划,维护并促进大熊猫的生境状况是当务之急.SSR标记能作为分析和解决这些问题的最有效的工具,得到了相关领域研究人员的认可.但是,大熊猫基因组SSR标记的开发工作开展甚少,目前仅仅36个位点被分离.此外,对大熊猫进行相关的分子遗传分析,获取基因组DNA相当困难,因此,其相关工作很难在各个实验室得到广泛开展.针对上述有关问题,该文以大熊猫血液、毛发和粪便为材料,进行了非损伤性样品DNA的提取研究和SSR标记的分离工作,主要结果如下:1.在粪便DNA的提取过程中采用一个新的预处理方法,将粪便用预冷的丙酮洗2~3次,除去粪便中含有的大量PCR抑制物,然后蛋白酶K裂解、酚-氯仿抽提,能提取到纯度很高的DNA供PCR扩增.该实验PCR扩增了大熊猫脑源性神经营养因子(BDNF)基因和线粒体细胞色素b基因片段,并进行测序分析,证实了提取的可靠性.对比该方法和未经丙酮预处理的方法提取的DNA进行PCR扩增,前者的扩增结果明显优于后者.2.以血样DNA为材料,用两种以PCR为基础的分离SSR的方法(RAMS和MP-PCR)分离大熊猫的SSR标记,RAMS策略获得3个(其中只有一个是很好的SSR),MP-PCR策略获得17个(其中只有三个含两侧的保守序列,其余均只有一侧的保守序列).通过比较分析这两种方法,建立了一种简单的从毛发DNA中快速分离SSR标记的方法,并分离到四个非常好的SSR位点.

目录

文摘

英文文摘

一.前言

1.非损伤性取样法提取DNA的研究进展

2.SSR标记的特点和应用

3.SSR分离方法的研究进展

4.本项目研究的目的和内容

二.材料与方法

1.实验材料

1.1大熊猫材料

1.2主要试剂

1.3主要溶液

2.实验方法

2.1 DNA的提取

2.2粪便DNA的检测

2.3 RAMS策略分离SSR

2.4MP-PCR策略分离SSR

2.5改进的策略分离SSR

2.6序列分析和SSR引物设计

三.实验结果

1.粪便DNA的检测结果

1.1粪便DNA的PCR扩增检测结果

1.2 DNA扩增片段的测序与分析结果

2.RAMS策略分离SSR的结果

2.1 RAPD产物电泳

2.2点杂交和阳性片段的测序

3.MP-PCR策略分离SSR的结果

3.1 MP-PCR扩增结果

3.2克隆和测序结果

4.改进的策略分离SSR的结果

4.1 PCR产物的克隆结果

4.2筛选含SSR的克隆的结果

4.3含SSR的克隆的测序结果

5.序列分析和SSR引物设计

四.讨论

1.粪便DNA的提取

2.RAMS策略的分析

3.MP-PCR策略的分析

4.改进方法的分析

5.几种分离方法的比较分析

6.后续工作

参考文献

缩写词

致谢

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