甲醛对类香草素受体的激活作用和甲醛诱导型哮喘分子机理的研究

摘要

近年来，关于室内空气甲醛污染与人体健康效应的研究日益广泛深入。甲醛引起的气道神经源性炎症、获得性过敏体质现象等生物学效应，都涉及甲醛触发性生物靶分子介导的病理学过程。1991年丹麦学者G.D.Nielsen首先提出假说：室内空气污染物(如甲醛)所致的气道刺激作用是一种受体介导的病理学过程，这种受体可能是辣椒素受体，现已证实辣椒素受体即为类香草素受体，它们分布于气道黏膜中神经末梢的细胞膜上。由于当时和后来对这种膜受体蛋白本质的认识还非常有限，他所提出的假说一直没有得到科学实验的证实。1997年美国加洲大学DavidJulius教授课题组首次鉴定并命名了类香草素受体(vanilloidreceptorsubtype1,VR1)，他们构建了大鼠感觉神经元VR1重组质粒，并成功地在人胚肾细胞(HEK-293细胞)和非洲爪蟾卵母细胞(Xenopuslaevisoocyte)中表达出VR1膜蛋白/离子通道，建立了VR1+重组细胞，进行了有关VR1的分子生物学、电生理学研究，并应用于疼痛传导机制和分子药理学的研究，其多篇研究论文在《Nature》和《Science》上发表。VR1+重组细胞的建立为检验和完善Nielsen假说提供了坚实的物质基础。我们将该受体的研究引入环境医学领域，很可能导致对室内空气污染与疾病关系分子机理的研究(如甲醛诱导型哮喘)取得重要进展。 本课题就甲醛对VR1的激活作用开展了体外和体内实验研究，阐明甲醛触发性生物靶分子的作用机理，验证Nielsen假说的正确性；在此基础上开展了甲醛诱导型哮喘分子机理的实验研究，结果如下： 1.VR1+-HEK293细胞模型的构建和Nielsen假说的验证为研究VR1作为室内空气污染物的触发性生物靶分子的生理作用，在VR1-cDNA质粒基础上，应用分子克隆和细胞转染技术构建了体外培养的VR1+-HEK293细胞模型，并应用此细胞模型进行辣椒素和甲醛致VR1+-HEK293细胞死亡实验。结果表明，VR1+-HEK293细胞模型构建成功，VR1+细胞死亡实验是一种简便有效的鉴定VR1体外表达的实验方法；甲醛能够激活VR1，且激活反应能被VR1特异性拮抗剂capsazepine所阻断，从而推断甲醛对气道的刺激作用也可能是通过VR1所介导的。用体外细胞学实验证实了VR1是甲醛作用的生物靶分子，以实验证实了Nielsen假说的正确性。 2.非洲爪蟾卵母细胞电压钳实验1997年DavidJulius教授课题组建立的VR1+细胞模型，将VR1从体内错综复杂的神经网络系统中游离出来，使得利用体外细胞表达系统对其进行针对性的全面深入研究成为可能。甲醛是否可以作为配体激活VR1，产生气道刺激作用，通过第一套VR1信号传递系统(FA/VR1/Ca2+/SP/NKR)介导神经源性炎症，通过第二套VR1信号传递系统(FA/VR1/Ca2+/IL-4/IgE)导致机体获得性过敏体质的形成，以及其他的室内空气污染物，如可吸入颗粒物PM2.5、增塑剂邻苯二甲酸酯(PAEs)等是否也可以激活VR1，介导上述毒性作用，电压钳实验是最为有力的检验手段。由于电生理记录是技术难度最大操作最复杂的实验环节，我们首先开展了非洲爪蟾卵母细胞内源性ATP激活电流的研究。在带有滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞中，记录到了3种形式的电流，分别是ATP所激活的内源性膜电流(IATP)的3个成分：快内向电流(earlyfastdepolarizingcurrent，ID1)；较慢的内向电流(lateslowdepolarizingcurrent，ID2)和缓慢的外向电流(slowhygerpolarizingcurrent，IH)。其结果与李之望教授课题组报道的实验结果一致，说明我们的电生理记录是成功的。目前我们已完成体外转录、显微注射和卵母细胞离体培养，预期得到VR1++非洲爪蟾卵母细胞，进行甲醛激活VR1电压钳实验。 3.非致炎浓度的福尔马林激活小鼠皮肤类香草素受体为探索非致炎浓度的福尔马林对小鼠皮肤类香草素受体(VR1)的激活作用。我们选用雄性KM小鼠随机分为3组：福尔马林(formalin，FM)组、辣椒素(capsaicin，CAP)组和Capsazepine(CPZ)组。采用注射后5min内小鼠舔舐注射脚掌的时间作为评价疼痛反应的指标，对各组小鼠分别进行疼痛学观测。结果表明，0.025％FM和200μmol/LCAP是理想的实验浓度，即既能引起显著疼痛反应，又不引起炎性损伤的致痛浓度，适于研究受体拮抗剂的抗疼痛作用；1μmol/LCPZ分别与200μmol/LCAP和0.025％FM共注射能有效的拮抗CAP和FM引起的疼痛反应。我们推论，非致炎浓度FM所致的疼痛反应在外周可能是通过VR1介导的。福尔马林实验从体内水平研究了甲醛对VR1的激活作用，也是电压钳等体外实验的有力佐证。 4.获得性过敏体质：甲醛诱导型哮喘一种可能的发病机理近几十年来世界范围内哮喘发病率不断增长，尤其是西方发达国家。但是哮喘的发病机理并不清楚，近来室内空气污染物作为哮喘发病的诱发因素得到越来越多的研究。我们将25只雄性BALB/c小鼠随机分为5组，分别进行气态甲醛浓度为0，0.5，1.0，3.0mg/m3和3.0mg/m3+Capsazepine预处理(CPZ，VR1特异性拮抗剂)的职业暴露模型(6h×10d)的处理，检测肺泡灌洗液中过敏体质的生物标志物IL-4和血清总IgE的水平。结果表明，小鼠BALF中IL-4的含量和血清总IgE的含量与气态甲醛暴露水平呈剂量效应关系，并且CPZ预处理3.0mg/m3甲醛暴露组与3.0mg/m3甲醛暴露组相比，IL-4和IgE水平显著下降。我们推论，甲醛暴露可以通过第二套VR1信号传导系统(typeⅡVR1signalingsystem)导致机体获得性过敏体质(acquiredatopy)的形成，从而可以易化哮喘的发生。以甲醛为代表的室内空气污染物可能是哮喘发病率增长的重要因素，而第二套VR1信号传导系统是哮喘发病率增长的可能机制。 5.亚硝基谷胱甘肽还原酶(GSNOR)：甲醛诱导型哮喘一种新的可能的发病机理亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathionereductase，GSNOR)是近年来颇受重视的蛋白质分子，因为它可以使亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione，GSNO)降解，而后者又是体内对抗气道高反应性的重要生物活性分子。最新研究表明，气道中的NO和“活性NO”(GSNO)的联合作用具有重要的生理学和病理学作用。GSNOR可以调节NO和GSNO的平衡，非常有趣的是，现已发现GSNOR就是甲醛脱氢酶(formaldehydedehydrogenase，FDH)，FDH被认为是机体甲醛代谢的主要酶类。我们提出的假说：吸入的气态甲醛可以在基因水平上使GSNOR的表达上调，进而导致气道中GSNO水平下降，气道张力上升；当存在哮喘的其他病原时，可以诱导哮喘发作。我们将18只雄性昆明小鼠随即分成3组，进行连续72h浓度分别为0，1.0，3.0mg/m3的气态甲醛染毒，采用RT-PCR检测肺组织中GSNOR-mRNA转录水平，结果表明，气态甲醛能诱导GSNOR转录水平的上升，从而下调GSNO水平，且与我们前期研究气态甲醛(1.0mg/m3以上)诱导肺组织NO水平升高的结果一致，验证了NO和GSNO的平衡在调节气道中的生理学和病理学作用。

目录

文摘

英文文摘

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一.文献综述

1.VR1+—HEK293细胞模型的构建和Nielsen假说的验证

1.1环境医学悬案—Nielsen假说

1.2类香草素受体(辣椒素受体)

1.3 VR1+细胞模型构建的意义

2.非洲爪蟾卵母细胞电压钳实验

2.1非洲爪蟾卵母细胞生物学特性

2.2研究方案和技术路线

2.3用分子药理学实验手段解决环境医学问题

3.非致炎浓度的福尔马林激活小鼠皮肤类香草素受体

3.1理想的疼痛学动物模型——小鼠福尔马林痛觉模型

3.2类香草素受体(VR1)在痛觉传导中的重要作用

4.获得性过敏体质：甲醛诱导型哮喘一种可能的发病机理

4.1传统的过敏性哮喘发病机理学说

4.2一个重要的环境医学基础理论问题

4.3一种可以依靠的模型化合物——甲醛

4.4过敏体质激发原与获得性过敏体质假说

4.5第二套VR1信号传递系统

4.6非过敏原性空气污染物诱发哮喘的分子机理

5.亚硝基谷胱甘肽还原酶：甲醛诱导型哮喘一种新的可能的发病机理

5.1甲醛激活GSNOR并影响气道中NO与GSNO的平衡和哮喘发生

5.2 GSNOR调控的NO与GSNO的平衡

5.3我们的假说

二.材料与方法

1.实验材料

1.1 BLAB/c小鼠和KM小鼠

1.2 DH5a大肠杆菌

1.3人胚肾细胞系HEK293细胞

1.4非洲爪蟾卵母细胞

1.5主要试剂

1.6主要溶液

1.7主要仪器

2.实验方法

2.1 VR1+-HEK293细胞模型的构建和Nielsen假说的验证

2.2非洲爪蟾卵母细胞电压钳实验

2.3非致炎浓度福尔马林激活小鼠皮肤类香草素受体实验

2.4甲醛诱导获得性过敏体质小鼠肺泡灌洗液IL-4和血清总IgE的检测

2.5 RT-PCR法检测气态甲醛调节小鼠肺组织GSNOR的转录水平

2.6统计分析

三.实验结果

1.VR1+-HEK293细胞模型的构建和Nielsen假说的验证

1.1 VR1-pcDNA3质粒转化、扩增、酶切鉴定结果

1.2不同浓度CAP对正常HEK293细胞存活的影响

1.3 CAP致VR1表达细胞死亡实验

1.4 FA致VR1表达细胞死亡实验结果

2.非洲爪蟾卵母细胞电压钳实验

2.1卵母细胞标本的制备

2.2非洲爪蟾卵母细胞内源性ATP激活电流

3.非致炎浓度的福尔马林激活小鼠皮肤类香草素受体

3.1不同浓度福尔马林致小鼠疼痛反应实验结果

3.2不同浓度辣椒素(CAP)致小鼠疼痛反应实验结果

3.3 CPZ抗CAP致痛作用的实验结果

3.4 CPZ抗FM致痛作用的实验结果

4.获得性过敏体质：甲醛诱导型哮喘一种可能的发病机理

4.1气态甲醛染毒浓度的测定结果

4.2小鼠肺泡灌洗液IL-4检测结果

4.3小鼠血清总IgE检测结果

5.亚硝基谷胱甘肽还原酶：甲醛诱导型哮喘一种新的可能的发病机理

5.1 RT-PCR法检测气态甲醛调节GSNOR的转录水平(预实验)

5.2小鼠肺组织中一氧化氮合酶(NOS)活力水平的检测

5.3小鼠肺组织中一氧化氮(NO)的检测

四.讨论

1.VR1+-HEK293细胞模型的构建和Nielsen假说的验证

1.1CAP致VR1表达细胞死亡的特性

1.2检测VR1表达的新方案

1.3对Nielsen假说的验证

1.4与电压钳实验的印证

2.非洲爪蟾卵母细胞电压钳实验

2.1电压钳实验的意义

2.2非洲爪蟾卵母细胞内源性ATP激活电流实验

2.3下一步实验计划

3.非致炎浓度福尔马林激活小鼠皮肤类香草素受体

3.1福尔马林的最适致痛剂量

3.2伤害性感受器拮抗剂的有效浓度

3.3FM所致疼痛的外周传导机制

3.4 Nielsen假说的验证

3.5甲醛与VR1

3.6不同浓度福尔马林的致痛机理

4.获得性过敏体质：甲醛诱导型哮喘一种可能的发病机理

4.1第二套类香草素受体信号传递系统

4.2甲醛诱导型哮喘发病机理的探讨

5.亚硝基谷胱甘肽还原酶（GSNOR）：甲醛诱导型哮喘一种新的可能的发病机理

5.1气道中的NO和GSNO对气道的联合调节作用

5.2有益的理论探索

五.结论

六.参考文献

主要英文缩写词

附录一 硕士在读期间学术成果

附录二 分子生物学和电压钳实验操作

附录三 标准气态甲醛动态染毒装置

附录四 声学传感器法小鼠哮喘模型体征监测装置

致谢