人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1预防性疫苗的研究

摘要

人乳头瘤病毒(HPV)感染属于严重的性传播疾病，给人类健康带来很大的影响，临床学、分子生物学和流行病学调查已经证明人乳头瘤病毒是宫颈癌的主要病因，并且随着科学技术的快速发展，分子生物学和基因工程技术的应用不断进步，预防和治疗宫颈癌的疫苗倍受许多科学家的重视。因此，此项疫苗的研究具有非常重要的社会效益和经济效益。 目前大多数关于HPV疫苗的研究都是以其晚期蛋白L1或L1+L2 所形成的病毒样颗粒(VLPs)为基础进行的，在本实验中，我们应用毕赤酵母表达系统开展了基因工程 HPV16L1 预防性疫苗的研究工作，取得了一些进展，为该疫苗的进一步发展奠定了基础。实验期间主要得到了以下几个方面的结果： 1)搜索Genebank 中有关HPV16L1 的基因序列，共搜索到30 条较完整的序列，用软件 AlignX 进行序列比对，确定同源性最大的氨基酸序列，再根据毕赤酵母密码子进行优化，送上海生工合成，但三个月后送来两个片段，两片段间有一段重复序列(其中都含有 BglⅡ的酶切位点)，将两个片段分别酶切后通过 BglⅡ进行连接，将连接产物作为模板，进行 PCR 反应，将其产物进行鉴定，合成了全长为 1536bp 的 HPV16L1 基因。 2)构建了酵母重组质粒 pAO819-16L1，经酶切鉴定正确后通过电击转化到酵母菌株 GS115 中，经 G418 抗性筛选获高拷贝工程菌并用甲醇(1％)诱导进行表达，每隔 24h 补加甲醇1％，在诱导后48h、72h 和 96h 收菌，用 Western Blot鉴定现在55KD 处出现特异性的条带，而阴性对照中未出现目的条带，发现诱导后72h表达量最高。 3)构建原核重组质粒 pET43.1a-16L1，经酶切鉴定正确后转化至 BL21 codonplus(DE3)和BL21 cedonPlus(DE3)-RILP 菌株中进行表达，目的蛋白以包涵体的形式存在，通过8M尿素变性处理后过离子交换树脂，分阶段进行洗脱，0.1MNaCl可洗脱杂蛋白，0.5MNaCl 可洗脱目的蛋白，纯度可达80％以上，以便对酵母表达的目的蛋白进行阳性对照。 4)构建了真核重组质粒 pDRVI1.0-16L1，经酶切和测序鉴定正确后，用试剂盒大提质粒免疫小鼠，共免疫四针，每次免疫后通过电穿孔加强免疫效果，制备了抗 HPV16L1 的抗血清，通过 WB 鉴定后发现该抗体能产生特异性的条带，滴度较高，但特异性不强。

目录

文摘

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声明

第一章前言

1.1人乳头瘤病毒简介

1.1.1人乳头瘤病毒的病原学

1.1.2人乳头瘤病毒的分子结构

1.1.3人乳头瘤病毒的免疫学

1.2毕赤酵母表达系统简介

1.2.1毕赤酵母载体

1.2.2毕赤酵母菌株

1.3人乳头瘤病毒疫苗的研究进展

1.3.1预防性疫苗

1.3.2治疗性疫苗

1.3.3兼有双重作用的嵌合疫苗

1.3.4树突状细胞疫苗在HPV感染中的应用

1.4该项目的目的和意义

参考文献

第二章酵母重组质粒的构建和表达

2.1实验材料

2.1.1工具酶和主要生化试剂

2.1.2试剂盒

2.1.3质粒、菌株和抗体

2.1.4主要仪器

2.1.5常用溶液的配制

2.2实验方法

2.2.1目的基因的合成

2.2.2酵母重组质粒的构建和序列测定

2.2.3目的蛋白在酵母细胞中的表达和鉴定

2.3实验结果

2.3.1目的基因的合成

2.3.2酵母重组质粒的鉴定

2.3.3目的基因的序列测定

2.3.4目的蛋白在酵母细胞中的表达和鉴定

2.4讨论

参考文献

第三章原核重组质粒的构建和表达

3.1实验材料

3.1.1工具酶和主要生化试剂

3.1.2质粒、菌株和抗体

3.1.3主要仪器

3.1.4常用溶液的配制

3.2实验方法

3.2.1原核重组质粒的构建和鉴定

3.2.2原核重组质粒的表达和鉴定

3.2.3目的蛋白的纯化

3.3实验结果

3.3.1原核重组质粒的构建和鉴定

3.2.2原核重组质粒的表达和鉴定

3.2.3目的蛋白的纯化

3.4讨论

参考文献

第四章抗血清的制备

4.1实验材料

4.1.1工具酶和主要生化试剂

4.1.2试剂盒

4.1.3质粒与实验动物

4.1.4主要仪器

4.1.5常用溶液的配制

4.2实验方法

4.2.1DNA疫苗重组质粒的构建和鉴定

4.2.2免疫小鼠

4.2.3抗血清的制备

4.2.4抗血清的检测

4.3实验结果

4.3.1DNA疫苗重组质粒的构建和鉴定

4.3.2免疫小鼠

4.3.3抗血清的检测

4.4讨论

参考文献

第五章总结

附录

致谢