有机磷农药甲基对硫磷降解菌的代谢途径及酶学性质研究

摘要

有机磷农药（Organophosphate pesticides，OPs）是目前全世界广泛使用的一类农药，是主要的农药污染源。由此所引发的环境污染严重威胁人畜生命安全，制约着经济和社会可持续发展。筛选高效广谱的农药降解功能菌，通过环境微生物或微生物源酶制剂来消除有机磷农药污染具有效率高、成本低、降解彻底、无二次污染等优点，是修复有机磷农药污染土壤的有效途径之一，并已成为相关研究的热点。本研究从长期受有机磷农药污染的环境中分离得到两株有机磷农药高效降解菌，并对其降解特性、代谢途径、分子机制和初步应用等方面进行了研究。 从湖北沙隆达农药厂废水污泥和湖北黄冈市长期施用有机磷农药的棉田土壤中取样，分离得到两株有机磷农药高效降解菌HS-D36和HS-D38。HS-D36能高效降解甲基对硫磷（Methyl parathion，MP），但对农药中间体对硝基苯酚（p-Nitrophenol，PNP）降解能力相对较弱；而HS-D38能高效降解高浓度对硝基苯酚，并以它作为唯一的碳源和氮源生长，但该菌只能部分降解甲基对硫磷。对两株降解菌进行了形态观察和生理生化鉴定，结合16s rDNA分子水平鉴定，HS-D36鉴定为施氏假单胞菌属（Pseudomonas stutzeri），HS-D38鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。研究表明，HS-D36能于3h内对50 mg/L甲基对硫磷降解率达到90％，12h内将50 mg/L对硝基苯酚完全降解；HS-D38能部分降解50 mg/L甲基对硫磷，降解过程没有对硝基苯酚的积累，并在12h内将500 mg/L的高浓度对硝基苯酚完全降解。广谱特性研究表明，HS-D36菌株24h内对50 mg/L的毒死蜱和甲胺磷降解率达到80％以上，能部分降解辛硫磷、三唑磷和乐果：Hs-D38能降解50 mg/L乙酰甲胺磷、毒死蜱和乐果降解率达70％以上，对三唑磷和甲胺磷也有较强的降解能力，表现出较好的广谱降解特性。两菌株对有机磷农药及其中间产物的高效降解鲜见报道。 以HS-D36基因组DNA为模板，设计特异性引物，PCR扩增并克隆了有机磷水解酶基因opd（长为996bp，GenBank NΩ：EF515812）。对测序结果进行Blast比对，同源分析发现，opd基因与来自于甲基对硫磷降解菌Pseudomonas sp.WBC-3的mpd基因同源性高达99％。将opd基因亚克隆到高效表达载体pET-28a，构建重组表达载体pET-opd，转化至大肠杆菌BL21菌株中进行原核表达。SDS-PAGE分析可见35kD处有一强特异性条带。通过超声波裂解细胞，提取甲基对硫磷水解酶粗酶液，对酶学特性进行了研究。OPD酶的最适作用温度为30℃、最适pH值为10.0，金属离子Zn2+、Cd2+、Fe3+、Cr2+、Co2+对酶活力有不同程度的激活效应，Na+、Ni2+、Cu2+、K+、Mg2+则对其活性有抑制作用。 运用生物信息学手段，对目前国内外已经报道的有机磷水解酶基因进行了系统检索和同源比对。结果表明，来自不同菌株的OPD、MPD、OPH和MPH等都属于有机磷水解酶家族。有机磷水解酶OPD与来自Pseudomonas sp.WBC-3的甲基对硫磷水解酶MPD（AAP06948.1）的同源性高达99.0％，而与来自于Flavobacterium sp.的对硫磷水解酶PTE（AAA24930.1）和来自于Escherichia coli K-12磷酸三酯酶PTE（AAA58176.1）的同源性都很低。OPD的二级结构预测结果表明，在opd基因序列开放阅读框中有四个保守区域，分别定位于48-56，131-145，225-230，290-297之间，该区域中α-螺旋和β-折叠二级结构丰富。定位于137-145和225-230之间的氨基酸残基所形成的结构域与β-内酰胺酶家族结构域一致，表明OPD属于β-内酰胺酶家族。以MPD（PDBID：1P9E）为模板，对OPD酶的三维结构进行同源模建分析。结果表明，OPD酶的三级结构由两个独立的同型单体组成，每个单体由两个αβ/βα二聚体折叠而成，二聚体含金属离子活性中心前体，金属离子中心附近的空穴代表底物结合位点。成熟的OPD酶由含二价金属离子Zn2+和Cd2+的两个同型单体紧密结合形成的金属酶。 薄层色谱（TLC）结合光谱学（UV-vis Spectra）分析表明，HS-D36降解MP的第一步代谢主要中间产物为PNP。通过化学萃取HS-D38降解PNP的降解液中间产物，进一步运用GC和LC-ESI/MS等方法，确定了HS-D38对PNP降解的关键中间产物是对苯二酚（HQ）和1，2，4-苯三酚（1，2，4-BT）等。底物利用实验表明，HS-D38能较好利用HQ和1，2，4-BT。上述结果表明HS-D38是经过HQ途径降解PNP。初步确定了HS-D36和HS-D38协同矿化MP的最终代谢途径，即通过HS-D36降解MP生成PNP，而PNP在HS-D38的降解作用下，经HQ途径进一步降解生成HQ，HQ经羟化生成1，2，4-BT，并最终进入TCA循环，矿化为无机小分子物质。HQ转化为1，2，4-BT在假单胞菌属中首次发现和报道。 外加碳源和氮源对菌株的降解实验表明，HS-D38在ANM培养基中，对PNP的降解速度明显加快，而在ACM培养基中降解速度减慢。HS-D36降解MP和HS-D38降解PNP的反应均符合一级反应动力学，模拟结果与动态扫描分析结果一致。而外加碳源和氮源对HS-D36降解MP都具有促进作用。不同菌株对模拟农药废水中COD的去除能力不同，投加混合菌群较投加单一菌株效果更理想，对COD的去除率高达73.0％，而添加一定量的碳源和氮源，混合菌株对模拟农药废水COD的去除率提高到88.1％。这一实验结果对菌株的投放生产和实际应用具有指导意义。

目录

文摘

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论文说明：缩写中英文对照表

声明

第一章文献综述

1.1有机磷酸酯类化合物

1.1.1有机磷类杀虫剂

1.1.2有机磷类神经毒剂

1.2有机磷农药的毒理效应

1.3有机磷农药的环境归趋与污染修复

1.3.1环境归趋

1.3.2污染修复

1.3.3生物降解

1.4有机磷降解酶

1.4.1 OPH/opd酶类

1.4.2 ADPase/adpB酶类

1.4.3 B-5/opd水解酶类

1.4.4 OPDA/opdA酶类

1.4.5 HocA/hocA酶类

1.4.6 MPD/mpd酶类

1.4.7 OPAA/opaA酶类

1.5硝基酚类化合物的微生物降解

1.5.1硝基酚类化合物的微生物降解

1.5.2硝基酚类化合物的降解途径

1.5.3硝基酚类化合物降解酶

1.5.4硝基酚类化合物的共代谢

1.6生物信息学在环境微生物降解代谢研究中的应用

1.6.1微生物基因组学

1.6.2基因芯片在环境微生物研究中的应用

1.6.3生物信息学在有机污染物微生物降解研究中的应用

1.7立项依据及研究目的

1.7.1立项依据

1.7.2研究目的

第二章高效降解菌的分离及其生物学特性研究

2.1引言

2.2实验材料

2.2.1 采样

2.2.2菌株和质粒

2.2.3化学药品和抗生素

2.2.4工具酶和生化试剂

2.2.5常用缓冲液

2.2.6常用培养基

2.2.7主要仪器和设备

2.3实验方法

2.3.1降解菌的富集筛选

2.3.2菌体生长量及底物测定

2.3.3细菌鉴定

2.3.4菌株广谱降解特性

2.4结果与分析

2.4.1降解菌的筛选

2.4.2降解菌的形态及生理生化鉴定

2.4.3降解菌的16S rDNA分子鉴定

2.4.4动态降解

2.4.5降解特性研究

2.4.6有机磷农药广谱降解特性

2.4.7芳香族化合物的广谱降解特性

2.5讨论

第三章 有机磷水解酶OPD的基因克隆表达及其结构分析

3.1引 言

3.2实验材料

3.2.1菌株和质粒

3.2.2凝胶及主要缓冲液

3.2.3其它

3.3实验方法

3.3.1细菌基因组DNA的提取

3.3.2细菌质粒的提取

3.3.3 DNA限制性内切酶消化

3.3.4 DNA片段的回收

3.3.5甲基对硫磷水解酶基因opd的克隆

3.3.6原核细胞中重组质粒的筛选

3.3.7重组OPD酶原核表达及SDS-PAGE分析

3.3.8重组甲基对硫磷水解酶OPD的初步研究

3.3.9 OPD酶同源性分析及二级结构预测

3.3.10同源模建分析

3.4结果与分析

3.4.1甲基对硫磷水解酶基因opd的克隆

3.4.2重组质粒pMD-opd的构建及鉴定

3.4.3重组表达质粒pET-opd的构建及鉴定

3.4.4 opd基因在大肠杆菌E.coli BL21中的表达与鉴定

3.4.5酶活性分析

3.4.6有机磷水解酶的生物信息学分析

3.4.7 OPD的二级结构预测

3.4.8 OPD的高级结构同源模建分析

3.5讨论

第四章 降解菌的代谢途径及其应用研究

4.1引言

4.2实验材料

4.2.1受试菌株

4.2.2农药及化学试剂

4.2.3培养基

4.2.4缓冲液

4.2.5仪器设备

4.3分析方法

4.3.1常规分析测定方法

4.3.2代谢物薄层色谱分析

4.3.3 GC分析

4.3.4 LC-ESI/MS分析

4.3.5 COD的测定

4.4结果与分析

4.4.1代谢产物的TLC分析

4.4.2代谢产物的光谱学分析

4.4.3气相色谱(GC)分析

4.4.4液相色谱-质谱(LC-ESI/MS)分析

4.4.5 MP的降解代谢途径

4.4.6 HS-D38降解PNP的动力学分析

4.4.7 HS-D36降解MP的动力学分析

4.4.8降解菌对模拟农药废水的应用研究

4.5讨论

第五章结论

5.1论文小结

5.2本论文的创新点

5.3不足与展望

参考文献

博士期间发表的论文

博士期间参加的国际国内学术会议及论文

致 谢