细胞色素C在无细胞体系中对斜纹夜蛾细胞凋亡的影响

摘要

细胞凋亡是当今生命科学研究的热点，科学技术的进步与发展为细胞凋亡的研究提供了有力武器。比如无细胞体系，在细胞凋亡的应用中有不可取代的优越性。无细胞体系最初主要应用于细胞重大生命活动的机理研究。例如在亚细胞水平和分子水平上研究细胞核的体外重建、细胞周期的调控等。1993年，lazebnik等科学家首次将其应用于细胞凋亡的研究。无细胞体系在哺乳动物细胞和植物细胞凋亡的应用中已经取得了很多成果，但在昆虫细胞凋亡的应用中还正在深入。本文应用无细胞体系对昆虫细胞凋亡的有关方面进行了探讨和研究。我们以前的研究结果已证明，杆状病毒中的芹菜夜蛾核型多角体病毒SfMNPV和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV诱导的斜纹夜蛾（Spodoptera litura） S1-1细胞凋亡过程中，细胞色素C（cytc）从线粒体释放至胞质是细胞凋亡的关键步骤。本实验以S1-1细胞核为研究对象，用S1-1细胞浆制备的无细胞体系作为反应体系。在无细胞体系中以纯化的外源cytc作为诱导剂，诱导S1-1细胞核发生凋亡，研究了S1-1胞核凋亡的特征，进一步探究了cytc在昆虫细胞凋亡中的作用。主要工作包括以下几个方面： （1）外源cytc对S1-1细胞核的影响 细胞凋亡形态学判断是凋亡检测的经典标准，最为常用及最为简便的方法是使用荧光显微镜观察细胞核的凋亡过程。本实验采用DAPI染料，直接对细胞核进行染色，用荧光显微镜观察细胞核的形态变化。由于凋亡相关的特异核酸酶对细胞核染色质DNA进行特异切割，经琼脂糖凝胶电泳可见典型的梯形图谱。这是细胞凋亡一个强有力的生化指标。本实验提取凋亡细胞核DNA进行凝胶电泳，检测其DNA变化。通过上述两种方法研究了细胞色素C诱导S1-1细胞核发生凋亡的作用。 结果表明，一定浓度的外源cytc将无细胞体系激活为凋亡体系，细胞核在凋亡体系中，置28℃培养箱，分别孵育2hr，4hr，6hr，8hr。DAPI染色结果显示细胞核固缩并逐渐变形，核内染色质凝集并趋边化，有空泡形成。随着孵育时间的延长细胞核直至破裂成大量的小块而被核膜包裹，类似于凋亡体。细胞核孵育12 hr之后，荧光显微镜下几乎看不到完整的细胞核，整个视野中充满高亮度的细小的荧光球。这说明cytc可诱导S1-1细胞核发生凋亡。提取凋亡细胞核DNA经琼脂糖凝胶电泳呈现典型的凋亡细胞DNA梯形电泳谱带，且细胞核孵育时间越长，电泳梯形条带越明显。结果进一步证实了cytc可诱导S1-1细胞核发生凋亡。 （2） cytc对caspase-3活性的影响 检测细胞凋亡的另外一个重要生化指标是检测胱天蛋白酶的活性。如caspase-3，caspase-8，caspase-9等在细胞凋亡过程中被激活，由无活性的酶原成为有活性的酶。活化的caspase对其底物具有特异性切割性，通过这一特性来检验相应的胱天蛋白酶的活性。本实验应用荧光定量技术检测cytc诱导S1-1细胞核发生凋亡过程中caspase-3的活性变化。分别在孵育不同时间的凋亡体系中加入等量的caspase-3的特异性底物Asp-Glu-Val-Asp（DVED），根据底物被剪切的程度，用荧光定量法检测caspase-3的活性。 实验结果表明，cytc诱导S1-1细胞核发生凋亡过程中，caspase-3被激活，且其活性随着孵育时间的延长而增强。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.前言

1.1细胞凋亡概述

1.1.1细胞凋亡

1.1.2细胞程序性死亡(PCD)与细胞凋亡

1.1.3细胞凋亡与细胞坏死的区别

1.1.4细胞凋亡的生化及形态学特征

1.1.5诱导细胞凋亡的因子

1.2细胞凋亡的检测

1.2.1细胞形态学观测

1.2.2 DNA凝胶电泳

1.2.3 caspase-3活性的检测

1.3细胞凋亡的信号通路

1.3.1哺乳动物细胞凋亡信号通路

1.3.2昆虫细胞凋亡信号通路

1.4无细胞体系

1.4.1无细胞体系概述

1.4.2无细胞凋亡体系的制备方法

1.5半胱氨酸蛋白酶的特征及在细胞凋亡中的作用

1.5.1半胱氨酸蛋白酶的发现与特征

1.5.2 Caspase酶原的结构及分类

1.5.3 caspase在细胞凋亡中的作用

1.6本研究背景

2.实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1昆虫细胞，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒

2.1.2昆虫细胞培养基的配制

2.1.3主要药品与试剂

2.1.4溶液的配制

2.1.5实验所用仪器

2.2实验方法

2.2.1昆虫细胞培养

2.2.2甜菜夜蛾人工饲养、感染与病毒的虫体活化

2.2.3 AcMNPV感染滴度的测定(TCIDso)

2.2.4对照组即病毒感染Sl-1细胞的处理

2.2.5 Sl-1细胞无细胞体系的制备

2.2.6 Sl-1细胞核的制备

2.2.7细胞色素C将无细胞体系激活为凋亡体系过程其阈值的确定

2.2.8无细胞凋亡体系对Sl-1细胞核的诱导及鉴定

2.2.9 Sl-1细胞核在无细胞凋亡体系中的凋亡形态学观察

2.2.10细胞核DNA的提取与电泳分析

2.2.1l用荧光定量分析法检测Sl-1细胞核凋亡后caspase-3的活性

3.实验结果与分析

3.1 AcMNPV诱导Sl-1细胞凋亡的形态学观察

3.2 Sl-1细胞核在无细胞凋亡体系中的凋亡形态学观察

3.3 Sl-1细胞核DNA在凋亡体系中特异降解形成DNA梯形条带

3.4用荧光分光光度法检测caspase-3的活性

4.讨论

4.1无细胞体系在细胞凋亡中的优越性

4.2 cytc与细胞凋亡

4.3外源加入的细胞色素C在非细胞体系中诱导Sl-1细胞核凋亡

4.4外源加入的cytc在无细胞体系中对caspase-3活性的影响

4.5总结

参考文献

致 谢