稀有鮈鲫Foxl2和斑马鱼Zar1L基因克隆及其时空表达分析

摘要

稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）是我国特有的实验动物，其性别决定机制还不清楚。为了研究稀有鮈鲫性别决定的分子基础，本实验通过RT-PCR和cDNA末端快速克隆（SMART RACE）相结合的方法从稀有鮈鲫卵巢中克隆了Foxl2全长cDNA序列。稀有鮈鲫Foxl2cDNA序列全长为1700bp，其中5'非编码区221bp，3'非编码区558bp，开放式阅读框921bp，共编码306个氨基酸残基，包括由90个氨基酸组成的FH结构域(FH-domain)。将稀有鮈鲫FOXL2序列与其他物种FOXL2进行同源性比对，结果显示脊椎动物FOXL2FH结构域保守性最高，并且C-末端的保守性要高于N-末端。比较发现，稀有鮈鲫FOXL2同其它非哺乳类的脊椎动物一样，不包含聚丙氨酸，也不包含富含甘氨酸—脯氨酸区域。RT-PCR分析Foxl2基因在稀有鮈鲫各组织中的表达模式，发现该基因在眼、脑、鳃和性腺表达，肝、肠和肌肉也有微弱表达，卵巢的表达量远高于精巢。这种表达模式表明Foxl2的靶组织可能在脑—垂体—性腺轴上。雌二醇(E2)和二甲基睾酮(MT)用酒精配制终浓度为0.01μg/1，分别对出苗约1个月稀有鮈鲫幼苗处理30天后换正常曝气水饲养10天，每10天每组各提取3条幼鱼总RNA。用荧光定量PCR检测Foxl2的表达水平变化。结果显示，与对照相比，E2处理组30-40d Foxl2表达升高，而MT处理组的表达降低，表明Foxl2的表达受下游性激素的反馈调控。 母源性mRNA在卵母细胞中表达，在胚胎发育的早期过程中起重要作用。合子阻滞基因1(Zygote arrest1，Zar1)及Zar1-like(Zar1L)作为母源基因，在小鼠卵子—合子转变过程中发挥着极其重要的作用。Zar1及Zar1L在进化中保守，但Zar1在不同动物中的表达模式不尽相同。本研究以斑马鱼为对象，采用RACE技术获得了Zar1L cDNA全长，并采用RT-PCR技术检测Zar1和Zar1L在斑马鱼不同组织器官、卵母细胞和胚胎发育时期的表达情况。Zar1LcDNA的全长为1146bp，编码311个氨基酸残基，5'非编码区20bp，3'非编码区190bp。多重序列比对结果显示，C-末端的序列非常保守，Zar1和Zar1L C-末端的相似性高达74％，具有非典型的PHD结构域(plant homeo domain)，并具有两个C4类型的锌指结构。在基因结构上，Zar1和Zar1L均由四个外显子构成，两个基因的每一个外显子在大小上也比较相近。分子进化表明，斑马鱼Zar1和Zar1L属于两个不同的基因，可能是同一来源的祖先基因重复和进化的结果。RT-PCR结果表明，斑马鱼Zar1和Zar1L的表达模式相似，都是卵巢特异表达的基因，在卵母细胞及早期胚胎中可检测到大量转录本的存在，囊胚、原肠胚期后下降，但在整个胚胎发育期都可检测到转录本。斑马鱼Zar1和Zar1L mRNA的表达水平的一致性，似乎暗示着两个基因的功能基本一致。表达模式分析表明，Zar1和Zar1L可能与斑马鱼卵子—合子转变有关，也可能与其他的胚胎发育过程有关。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1．1鱼类性别决定和性别分化相关基因简介

1．1．2斑马鱼性别决定和性别分化的信号通路

1．1．3外源激素对鱼类性别分化的影响

1．3本项目的立项依据、目的和意义

2．材料与方法

2．2主要仪器设备

2．4实验方法

2．4．3 DNase I消化总RNA

2．4．5 SMARTTM RACE克隆基因全长

2．4．6 PCR产物纯化回收

2．4．8目的DNA片段与pMD18-T载体连接

2．4．12 Real-Time PCR检测Foxl2基因表达水平

2．4．14胚胎整体原位杂交

3．结果

3．1．2 RACE-PCR扩增Foxl2的全长

3．1．3 FOXL2同源性分析

3．1．4稀有鮈鲫Foxl2的组织表达分析

3．1．5性激素处理对稀有鮈鲫Foxl2表达的影响

3．2斑马鱼Zar1L基因的克隆及序列分析

3．2．1 RACE-PCR扩增Zar1L基因的全长

3．2．2 Zar1L的cDNA同源性分析

3．2．3系统进化分析

3．2．4斑马鱼Zar1和Zar1L组织表达分析

3．2．5斑马鱼Zar1和Zar1L在卵子发生时期的表达

3．2．7 Zar1和Zar1L在胚胎不同发育阶段的表达特征

4．讨论

4．2斑马鱼Zar1L基因的序列分析及表达模式分析

参考文献

在校期间论文发表情况

致谢