邻苯二甲酸酯致氧化损伤及促哮喘作用分子机理的初步研究

摘要

邻苯二甲酸酯(PAEs)主要作为增塑剂,在世界范围内广泛使用。随着工业化的发展,人类对PAEs的使用量逐年增多,其毒性作用被逐渐认识,引起的环境污染问题以及对人类健康的负面影响日益受到全球性关注。调查研究证实,PAEs已经广泛存在于水体、土壤、大气、食品、生物体中,成为环境中无所不在的污染物。PAEs可以通过消化道、呼吸道、皮肤以及医疗暴露等途径进入人体,对人类健康造成隐患。目前,对PAEs的毒性效应的研究主要集中在生殖发育毒性、肝脏毒性和致癌作用、免疫毒性、神经毒性等方面,但是至今仍然没有肯定的结论,也没有充足的实验证据能证明究竟哪一种PAEs可以引发疾病、肿瘤,乃至死亡。二十一世纪以来,国际上出现了一批高质量的关于PAEs暴露的人群流行病学研究报告,多将人体尿液或血液中邻苯二甲酸酯代谢产物的含量作为评价邻苯二甲酸酯对人类危害的可靠生物标志物。作为PAEs的第一生产大国和消费大国,虽然有研究指出我国人群的PAEs暴露水平已经超过许多发达国家,但我国至今尚未针对PAEs开展系统的人群流行病学调查,也未出台相应的国家环境安全标准。
　　 基于对以上问题的认识和思考,本研究主要从三个方面展开:①对部分人群的PAEs暴露水平进行抽样调查,采用国际上认可的人体尿液中邻苯二甲酸酯代谢产物单体的含量来评估；②通过体外实验,从氧化损伤的角度来探讨PAEs的生物毒性作用；③以DEHP为代表,对其致过敏性哮喘的分子机理进行初步研究。研究结果如下:
　　 1.通过对我国中学生随机调查取样,对其尿液中PAEs一级代谢产物进行检测,结果为:①MEHP的检出率为93.3％,MBP的检出率为56.7％,MBzP的检出率为70％,呈现:MEHP>MBzP>MBP的趋势,且女生中三种邻苯二甲酸酯一级代谢产物的检出率均高于男生。说明中学生普遍受到DEHP、DBP和BBP的暴露污染,其中DEHP的污染最为普遍。②MEHP的平均检出水平为29.0μg／L,MBP的平均检出水平为176.4μg／L,MBzP的平均检出水平为690.1μg／L。就检出的量来看,呈现出MBzP>MBP>MEHP的趋势。
　　 2.通过体外实验证明,随着DEHP和DBP染毒浓度的增大,大鼠肝脏细胞中的ROS水平、MDA含量和DPC系数逐渐上升,说明PAEs能够使细胞中ROS水平上升,导致氧化应激,并通过脂质过氧化作用及损伤细胞中的遗传物质等方式,对细胞及机体造成氧化损伤。
　　 3.用不同剂量DEHP对24只Balb／C小鼠进行连续14天灌胃染毒,提取小鼠肺组织总RNA,进行RT-PCR实验,扩增相关基因并进行半定量分析。实验结果证明,DEHP暴露能够导致GSNOR、TSLP和NGF基因的转录水平上调,但对TRPV1基因转录水平无明显影响,提示DEHP可能是通过GSNOR、TSLP和NGF三个基因分别介导的分子通路来诱导哮喘的发生。

目录

文摘

英文文摘

1.文献综述

1.1 邻苯二甲酸酯类化合物概述

1.1.1 PAEs的结构与理化性质

1.1.2 PAEs的种类

1.1.3 PAEs的来源及用途

1.2 邻苯二甲酸酯类化合物在环境中的分布、检测及降解

1.2.1 PAEs对水体的污染

1.2.2 PAEs对土壤的污染

1.2.3 PAEs对大气的污染

1.2.4 PAEs对食品的污染

1.2.5 PAEs的检测方法

1.2.6 PAEs的降解

1.3 邻苯二甲酸酯类化合物对人体的暴露途径及暴露水平

1.3.1 PAEs对人体的暴露途径

1.3.2 PAEs的人体暴露水平

1.4 邻苯二甲酸酯类化合物在体内的分布与代谢

1.4.1 PAEs在体内的分布

1.4.2 PAEs在体内的代谢

1.5 邻苯二甲酸酯类化合物的毒性效应

1.5.1 PAEs的动物毒理学研究

1.5.2 PAEs的人群流行病学研究

1.6 DEHP的促哮喘作用

1.6.1 哮喘概述

1.6.2 非过敏原性空气污染物致哮喘的分子机理

1.6.3 DEHP对哮喘的诱导作用

1.7 选题的目的与意义

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 人群调查对象

2.1.2 实验受试动物

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要溶液

2.1.5 主要仪器

2.2 人群调查实验--检测PAEs的人群暴露水平

2.2.1 样品采集

2.2.2 样品的保存与送检

2.2.3 样品的前处理方法

2.2.4 样品的检测方法

2.3 体外实验--PAEs的氧化损伤作用研究

2.3.1 大鼠肝脏细胞悬液的制备

2.3.2 染毒方法

2.3.3 ROS含量测定

2.3.4 蛋白质含量测定

2.3.5 MDA含量测定

2.3.6 DPC含量测定

2.4 体内实验--DEHP促哮喘作用分子机理的研究

2.4.1 染毒方法

2.4.2 引物设计

2.4.3 小鼠肺组织总RNA的提取

2.4.4 二步法RT-PCR反应

2.4.5 琼脂糖凝胶电泳检测

2.5 统计学分析

3.结果与分析

3.1 青少年尿样中PAEs代谢产物含量分析

3.1.1 中学生尿样中三种邻苯二甲酸酯一级代谢产物的含量统计

3.1.2 邻苯二甲酸酯一级代谢产物的检出率分析

3.1.3 邻苯二甲酸酯一级代谢产物的平均水平分析

3.2 PAEs剂量与氧化损伤水平之间的关系

3.2.1 DEHP剂量与肝脏细胞ROS水平之间的关系

3.2.2 DBP剂量与肝脏细胞ROS水平之间的关系

3.2.3 DEHP剂量与肝脏细胞MDA含量之间的关系

3.2.4 DBP剂量与肝脏细胞MDA含量之间的关系

3.2.5 DEHP剂量与肝脏细胞DPC含量之间的关系

3.2.6 DBP剂量与肝脏细胞DPC含量之间的关系

3.3 DEHP剂量与GSNOR表达水平之间的关系

3.4 DEHP剂量与TSLP表达水平之间的关系

3.5 DEHP剂量与NGF表达水平之间的关系

3.6 DEHP剂量与TRPV1表达水平之间的关系

4.讨论

4.1 中国青少年PAEs暴露水平现状分析

4.1.1 中国青少年PAEs暴露水平现状

4.1.2 PAEs暴露水平的生物标志物选择

4.2 PAEs的氧化损伤作用

4.2.1 氧自由基的产生

4.2.2 氧自由基的清除和氧化应激

4.2.3 氧化损伤作用

4.2.4 PAEs致大鼠肝脏细胞氧化损伤作用的探讨

4.3 DEHP促过敏性哮喘的可能分子机制

4.3.1 DEHP促过敏性哮喘可能的分子机制

4.3.2 DEHP诱导亚硝基硫醇还原酶(GSNOR)转录上调的分子机理

4.3.3 DEHP诱导胸腺激素淋巴细胞生成素(TSLP)转录上调的分子机理

4.3.4 DEHP诱导神经生长因子(NGF)转录上调的分子机理

4.4 下一步实验计划

结论

参考文献

附录

致谢