峨眉树蛙和斑腿树蛙MHCⅠ类基因的多态性及其进化

摘要

主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)是细胞表面的一类糖蛋白，在脊椎动物的免疫反应中起着重要作用。MHC是由多基因家族——MHC基因所编码的，其编码产物能够识别并结合病原体或寄生虫后将它们呈递给T细胞进而引起免疫应答反应。基于MHC在应对病原中的关键作用，MHC基因多样性高的个体可能因为能够对抗更广谱的病原而具有较高的适合度。已有的研究表明MHC基因具有极高的遗传多样性，病原驱动下的平衡选择可能在其中起着重要的作用。 适应于水陆生活的两栖类动物，其非常薄的柔嫩皮肤长期裸露在环境中使得它们很容易受到病原的侵袭。研究也表明传染病是近年来两栖类动物数量和种类剧减的主要原因之一。考虑到MHC在应对病原中的关键作用，研究两栖类动物MHC基因的进化机制不仅有理论意义还有实践意义。因此，拟以峨眉树蛙（Rhscophorus omeimontis）和斑腿树蛙（Rhscophorus megacephalus）为研究对象，通过分析两种树蛙MHCⅠ类基因多态性特征，试图解释其MHC基因的进化机制。 本文首先利用设计的一对兼并引物，通过进行RT-PCR扩增，克隆和测序了一个峨眉树蛙样品的MHCⅠ类基因，对测序反馈的结果比对、拼接，用BLAST同源性检索，确定扩增的目的序列是峨眉树蛙MHCⅠ类基因序列后，又进行了26只峨眉树蛙和11只斑腿树蛙实验。对最终获得的所有序列分析发现，27只峨眉树蛙和11只斑腿树蛙等位基因数目分别为21和7，其中在8个峨眉树蛙和2个斑腿树蛙的每个个体中等位基因数目可达5个，推断两种树蛙MHCⅠ类基因可能至少含有3个功能位点。两种树蛙核苷酸多样性（π）值分别为0.1445和0.127(非洲爪蟾为0.089)，核苷酸序列整体变异位点分别为46.72％和34.62％（非洲爪蟾为26.76％）。与MHCⅠ类基因多态性较高的非洲爪蟾相比，峨眉树蛙和斑腿树蛙的MHCⅠ类基因多样性较高。 结合大树蛙、经甫树蛙，中华蟾蜍等多个物种序列构建的系统发育树显示，峨眉树蛙和斑腿树蛙等位基因没有形成物种特有的单系，而是相互混合在一起，提示有跨物种多态性现象存在。另外，两种树蛙氨基酸距离分歧较大，暗示核苷酸非同义替换率（dN）高于同义替换率（ds）;在抗原结合区域(PBR)，核苷酸的非同义替换率(dN)也高于同义替换率（ds）;又用PAML中基于最大似然率的随机位点模型来分析正选择作用，使用M2a和M8来鉴别受到正选择的位点，共确定了两种树蛙MHCⅠ类基因16个有显著正选择作用的位点，暗示平衡选择可能发挥着作用。同时在峨眉树蛙和斑腿树蛙中还检测到有多个重组事件发生。暗示在峨眉树蛙和斑腿树蛙MHCⅠ类基因多态性的维持中，跨物种多态性、平衡选择以及重组起了关键作用。这对解释两栖动物MHC基因多态性的维持机制具有一定的理论意义。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1．1 MHC的结构和功能

1．1．1 MHC分子的结构及功能

1．1．2 MHC基因的结构

1．2 MHC基因的多态性研究进展

1．2．1哺乳类MHC基因多态性进进展

1．2．2鸟类MHC基因多态性研究进展

1．2．3鱼类MHC基因多态性研究进展

1．2．4爬行类MHC基因多态性研究进展

1．2．5两栖类MHC基因多态性研究进展

1．3 MHC的多态性维持机制

1．3．1平衡选择作用

1．3．2维持机制

2．1实验材料

2．1．1实验样品

2．1．2主要的实验试剂

2．1．3主要的实验仪器

2．2实验方法

2．2．1肝脏样品RNA的提取和检测

2．2．2 RNA反转录成cDNA过程

2．2．3设计兼并引物

2．2．4 RT-PCR扩增

2．2．5 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳、回收和纯化

2．2．6用PMD-19vector对PCR产物进行TA克隆

2．2．7连接产物转化、阳性单克隆菌落的挑选及检测、送样测序

2．2．8 MHC Ⅰ类基因的序列拼接及分析

第三章结果分析

3．1．2 MHC Ⅰ类基因的鉴定

3．2序列多态性分析

3．2．1核苷酸序列多态性分析

3．2．2氨基酸序列分析

3．2．3构建系统发育树

3．3跨物种多态性分析

3．4选择检测

3．4．1核苷酸和氨基酸等位基因之间距离

3．4．2 MHC Ⅰ类基因序列的选择作用

3．5重组检测

第四章讨论

4．1序列特征及多态性分析

4．2导致多态性高的原因分析

第五章结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢