PP2对渥曼青霉素诱导的小鼠空间记忆损伤的保护作用及机制研究

摘要

糖原合酶激酶3（Glycogensynthasekinase-3，简称GSK-3）广泛存在于真核生物细胞中，属于糖原合酶激酶家族，是一种多功能Ser/Thr蛋白激酶。GSK-3包括两种亚型，GSK-3α和GSK-3β，其中GSK-3β在体内广泛表达，并且参与机体内多个信号转导途径。研究表明，活化的GSK-3β能降低cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的表达并抑制其转录活性，但其机制尚不明确。
　　本实验中，我们以小鼠为研究对象，系统研究了PP2在GSK-3β活性改变对CREB的影响及可能机制中的作用。选择8周龄的雄性昆明小鼠40只，随机分为四组，分别是对照组、wort组、PP2组、wort+PP2组。每组小鼠经过六天的定位航行实验，第七天手术侧脑室给药，24小时后检测药物对记忆能力的影响，然后取海马用免疫印迹的方法检测相关蛋白的表达。结果表明:(1)水迷宫结果显示:经过6天的定位航行实验，小鼠能在极短的时间内找到隐藏平台，具有相对稳定的记忆，且各组小鼠间无显著差异。注药24小时后检测小鼠找到隐藏平台的潜伏期变化，结果发现:与对照组相比，wort组小鼠找到隐藏平台的潜伏期明显变长;在此基础上注射PP2后，小鼠找到隐藏平台的潜伏期变短。空间探索实验结果显示:穿过隐藏平台所在象限的次数减少(p＜0.001)以及在隐藏平台所在象限的时间减少(p＜0.01);相比于wort组，穿过隐藏平台所在象限的次数增多(p＜0.01)以及在隐藏平台所在象限的时间也增加(p＜0.01)。(2)免疫印迹结果显示:相比于对照组，wort组GSK-3β的总体水平无明显影响，但GSK-3β的Ser9位点的磷酸化程度显著性降低(p＜0.05)，PP2组的磷酸化水平没有明显改变;相比于wort组，wort+PP2组GSK-3β的Ser9位点的磷酸化水平也未发生明显改变。(3)wort组Fyn磷酸化水平明显高于对照组(p＜0.01)，单独给予PP2却显著性降低Fyn磷酸化水平(p＜0.01);相比于wort组，wort+PP2组的Fyn磷酸化程度显著性降低(p＜0.01)。(4)与对照组相比，wort组NR2B的Tyr1472位点磷酸化水平显著性增强(p＜0.01)，与wort组相比，wort+PP2组NR2B的Tyr1472位点磷酸化水平显著性降低(p＜0.001);各组间NR2B总量未发生明显改变。(5)相比于对照组，wort组CaMKⅡ的Thr286位点磷酸化水平有显著性增强(p＜0.01);与wort组相比，wort+PP2组CaMKⅡ的Thr286位点磷酸化程度降低(p＜0.05);各组间总的CaMKⅡ水平未发生明显变化。(6)相比于对照组，wort组CREB的Ser133位点磷酸化程度降低(p＜0.01);相比于wort组，wort+PP2组CREB的Ser133位点磷酸化水平增加(p＜0.05)，但各组间CREB的总体水平变化不明显。结论:wortmannin作为GSK-3β的激活剂，使GSK-3β过量表达，而GSK-3β可作为Fyn的上游激酶，影响Fyn的表达，而Fyn又能作用于NMDAR的重要调节亚基NR2B，使其磷酸化程度发生改变，离子通道开放，Ca2+内流，与CaM结合形成复合物作用于CaMKⅡ，使其活性发生改变，调控CREB的活性，最终对学习记忆造成影响。而PP2(Fyn的非特异性抑制剂)抑制Fyn的活性，从而逆转下游一系列的反应，最终对wort引起的学习记忆的损伤起到保护作用。本研究提出了一个新的信号途径即PP2可能参与GSK-3β对CREB活性的调节机制。本实验对于多种神经系统疾病（例如AD、PD）的治疗提供了一定的理论依据。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1 GSK-3β的结构及功能调节

1．1．1 GSK-3β的表达及结构

1．1．2 GSK-3β的功能及活性调节

1．2 Fyn的结构及功能调节

1．3 NR2B结构及功能

1．4 CaMKⅡ的结构及功能

1．5 CREB的结构及功能

2．材料及方法

2．1 材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 抗体

2．1．3 仪器

2．2 方法

2．2．1 溶液的配置方法

2．2．2 脑立体定位仪侧脑室注药

2．2．3 动物行为学检测

2．2．4 提取组织样品

2．2．5 BCA法测定蛋白样品的浓度

2．2．6 免疫印迹(Western blot)

2．3 数据分析

3．结果

3．1 Wort、PP2处理对小鼠空间记忆能力的影响

3．2 Wort、PP2处理对GSK-3β活性的影响

3．3 Wort、PP2处理对Fyn活性的影响

3．4 Wort、PP2处理对NR2B磷酸化水平的影响

3．5 Wort、PP2处理对CaMKⅡ活性的影响

3．6 Wort、PP2处理对CREB活性的影响

4．讨论

4．1 GSK-3β以及CREB活性的调控

4．2 GSK-3β活性改变对下游Fyn活性的影响

4．3 Fyn活性改变对NMDAR的影响

4．4 NMDAR离子通道的开放对CaMKⅡ活性的调控

4．5 CaMKⅡ活性的改变对CREB活性的调控

5．结论

参考文献

附录

致谢