单核细胞增生李斯特菌感染模型的建立及一株蜡样芽胞杆菌的鉴定和毒性研究

摘要

选择合适的感染宿主模型对于研究人类病原细菌的致病机制是非常重要的。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和果蝇(Drosophila melanogaster)因其背景资料丰富、繁殖快、操作方便简单等诸多优点，目前已成为研究病原细菌致病机制的新模型，在鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等病原细菌毒力因子的鉴定以及宿主抵抗微生物感染的信号通路和分子机制等研究中已得到了成功应用。 单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称Lm）是一种无芽孢兼性厌氧革兰氏阳性菌，在自然界中广泛分布。通过摄入污染了Lm的食物，能使人和动物罹患李斯特菌病(Listeriosis)，引起骨髓炎、脑膜炎、心肌炎、孕妇流产以及产褥感染等疾病，死亡率20％～30％或者更高，因此被世界卫生组织(WHO)列为关系食品卫生安全的重要的食源性致病菌之一。已有文献报道利用秀丽隐杆线虫和果蝇来研究Lm的致病性，然而不同实验室的结果相差较大，甚至截然相反。PrfA（Positive regulatory factor A）是Lm中调控绝大多数毒力基因转录表达的重要毒力因子，在细菌侵染宿主并导致疾病中起着至关重要的作用，缺失其编码基因prfA将极大降低该菌的致病能力。为了探究秀丽隐杆线虫和果蝇是否适合作为Lm感染的宿主模型，本研究通过比较Lm野生株EGDe和不同毒力的PrfA突变株对秀丽隐杆线虫的致病能力，以及比较喂饲和显微注射这些细菌对果蝇的侵染能力，从而建立适合Lm感染的宿主模型和操作方法。 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种好氧性、在厌氧条件下也能很好生长的革兰氏阳性杆菌，广泛分布于土壤、空气、灰尘、污水、动物肠道以及各类生熟食品中。根据中国食品污染物和食源性疾病监测网络统计，蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒占所有食物中毒事件的4.0％，为细菌性食物中毒的第四位。本论文对实验室分离得到一株蜡样芽孢杆菌进行了形态和生化鉴定，并利用秀丽隐杆线虫和果蝇为感染模型，对其毒性进行了初步研究。现将以上研究结果报告如下: 一、线虫不适合作为研究单核细胞增生李斯特菌致病机制的模型 本研究用Lm野生株EGDe和PrfA突变株（包括弱毒株ΔprfA、毒力回复株+prfA和高毒株+prfA*）喂饲秀丽隐杆线虫N2，并以线虫的良好食源大肠杆菌OP50以及非致病的无害李斯特菌（Listeria innocua）作为对照，检测Lm对线虫发育周期、寿命和产卵数的影响。结果显示:当以无害李斯特菌、Lm野生株以及PrfA突变株为食时，线虫的产卵数虽有所下降，但线虫不仅能够正常产卵，而且其发育周期和寿命均较以OP50为食时显著延长(P≤0.05);线虫体表和消化道中均可检测到大量李斯特菌，但粪便中的活菌数极少。以上结果说明Lm不能杀死秀丽隐杆线虫，对线虫也没有显著致病性，不适合作为研究Lm致病机制的感染宿主模型;而Lm可在线虫体表和消化道存在，暗示Lm可借助线虫在土壤环境中生存和传播。同时，为了研究线虫体内环境是否会对Lm的生存产生影响，用ΔprfA和野生型EGDe分别喂饲线虫，并将粪便中的细菌扩大培养后，再次喂饲线虫，如此反复10代，随机挑取20个在线虫体内传代的细菌提取基因组，测序检测SigB的蛋白质结构是否有变异。SigB因子是Lm中主要的压力胁迫因子，与Lm在高渗透压、高温、低温、氧化环境、低pH、高胆汁酸盐等环境胁迫压力下生存密切相关。结果显示:野生型EGDe经在线虫体内传代后，有3个克隆的SigB的氨基酸序列同时发生了两处突变，即苯丙氨酸突变成亮氨酸和组氨酸突变成酪氨酸，但三级结构预测显示这两处突变没有造成SigB蛋白质结构的变化;而在线虫体内传代了10代的△prfA，有5个克隆的SigB的精氨酸突变成了赖氨酸，三级结构预测显示该突变造成了SigB蛋白质结构较大的变化，暗示精氨酸突变为赖氨酸可能导致SigB蛋白质功能的变化。以上这些SigB氨基酸序列的突变可能是Lm为适应秀丽隐杆线虫肠道这样一个压力胁迫环境而做出的调整的结果，其可能的机制有待进一步深入研究。 二、果蝇可作为研究单核细胞增生李斯特菌侵染机制的模型 与秀丽隐杆线虫一样，使用果蝇作为研究宿主-病原菌相互作用的模型时，首先需要让病原菌感染果蝇，使其致病。感染果蝇可通过喂饲病原菌（喂饲法）和直接将细菌注射到果蝇的体腔（显微注射法）两种方式。喂饲法简单经济，但只有少数几种菌可以通过这种途径感染果蝇;注射法需要特殊的注射仪器和一定的技巧，但感染率很高。目前大多数病原菌都是通过这种感染果蝇。本实验比较了喂饲和显微注射Lm两种方法对果蝇的致病能力。在喂饲实验中，将Lm野生株EGDe、PrfA缺失株△prfA、PrfA蛋白组成性高表达突变株+prfA*三种菌株分别在改良的果蝇培养基中培养并喂饲果蝇W1118。结果显示:与在无菌的果蝇培养基上生长的果蝇相比，用Lm三种菌株喂饲果蝇时，果蝇的发育周期显著延长(P＜0.01)，产卵数显著降低(P＜0.01)，但成蝇鲜重、蛹鲜重和孵化率没有明显变化(P＞0.05)，同时不同毒性的Lm菌株对果蝇的致病性没有显著区别，表明喂饲法感染果蝇的致病效率不明显。而使用显微注射方法分别向果蝇W1118体腔注射了以上Lm三种菌株后发现:毒力最低的ΔprfA不能感染果蝇而导致果蝇死亡，而野生株EGDe和毒力最高的+prfA*均能感染果蝇而导致果蝇死亡，果蝇生存时间分别为(8.5±0.9)天和(6.9±0.6)天;+prfA*在果蝇体内增殖迅速，72h后达到了(4.3±0.5)×1010，而EGDe为(1±0.2)×1010，表明显微注射法可使Lm感染果蝇，且其感染效率随毒力因子增强而增加。该结果证明果蝇可以作为研究Lm致病机制的宿主模型，但是感染途径不能通过喂饲方法，而必须直接注射Lm到果蝇体腔。 三、一株蜡样芽孢杆菌的鉴定和利用秀丽隐杆线虫和果蝇为感染模型对其毒性的研究 蜡样芽孢杆菌是食品中最常检出的食源性病源微生物，对中国的食品安全造成严重的威胁。本文对实验室分离得到一株蜡样芽孢杆菌进行了形态、生理生化和分子生物学鉴定。结果显示:该菌在LB培养基上形成的菌落较大，表面粗糙，扁平，圆形或近似圆形，呈毛玻璃状或融蜡状;有芽孢，无伴孢晶体;葡萄糖试验、木糖-甘露醇试验、动力-硝酸盐试验、3％过氧化氢酶试验、甲基红试验(M.R.)和乙酰甲基甲醇试验(VP)均为阳性，西蒙氏柠檬酸盐试验为阴性;16S rDNA序列与NCBI公布的Bacillus cereus strain ZM01、Bacillus cereus strain AY01、Bacillus cereus strain L90相似性均达到99％以上;PCR能检出该菌具有蜡样芽孢杆菌肠毒素FM基因(entFM)、非溶血性的肠毒素Nhe基因(nheA、nheB和nheC)、高度特异性的旋转酶B亚基基因（gyrB），以及细胞毒素K基因(cytK)。以上结果证明该菌无论是菌落形态、生理生化和分子特征都与典型的蜡样芽孢杆菌一致，表明该分离株为蜡样芽孢杆菌。同时，本实验还利用秀丽隐杆线虫和果蝇对其毒性进行了初步研究，结果显示:该分离株能通过显微注射法感染果蝇，并在5-7天内导致果蝇死亡;以该分离株喂饲秀丽隐杆线虫N2，也可导致线虫在50小时内死亡。该结果不仅表明该菌具有很强的毒性，而且暗示秀丽隐杆线虫和果蝇可作为研究其致病机制的模型。

目录

声明

摘要

第一章引言

1．1单核细胞增生李斯特菌简介

1．1．1 PrfA因子

1．1．2 SigB因子

1．1．3单核细胞增生李斯特菌的感染动物模型

1．2秀丽隐杆线虫作为模式生物简介

1．2．1秀丽隐杆线虫的生物学特性

1．2．2秀丽隐杆线虫作为模式生物的优势

1．2．3秀丽隐杆线虫作为研究病原细菌致病机制的模型

1．2．4秀丽线虫作为探究单核细胞增生李斯特菌致病机制的模型研究进展

1．3果蝇作为模式生物简介

1．3．1果蝇的生物学特性

1．3．2果蝇作为模式生物的优势

1．3．3果蝇作为研究病原细菌致病机制的模型

1．3．4果蝇作为探究单核细胞增生李斯特菌致病机制的模型研究进展

1．4蜡样芽孢杆菌简介

1．4．1蜡样芽孢杆菌生物学特性

1．4．2蜡样芽孢杆菌的检测方法

1．4．3蜡样芽孢杆菌的毒素研究进展

1．5本研究的目的及意义

第二章线虫不适合作为研究单核细胞增生李斯特菌致病机制的模型

2．1实验材料与设备

2．1．1线虫、细菌及培养条件

2．1．2实验试剂及配制

2．1．3实验设备

2．2实验方法

2．2．1线虫的同步化

2．2．2检测不同培养基和抗生素对线虫生存和寿命的影响

2．2．3线虫发育周期的测定

2．2．4线虫寿命的测定

2．2．5线虫产卵数的测定

2．2．6线虫体表细菌计数方法

2．2．7线虫消化道细菌计数方法

2．2．8线虫粪便细菌计数

2．2．9线虫对食物的趋向性

2．2．10线虫发育周期中线虫的生长情况

2．2．11不同细菌喂饲线虫后的产卵数和孵化

2．2．12单核细胞增生李斯特菌在线虫体内传代培养

2．2．13单核细胞增生李斯特菌sigB基因的检测

2．2．14数据统计分析

2．3实验结果

2．3．1培养基和抗生素对线虫生存曲线和寿命的影响

2．3．2单核细胞增生李斯特菌对线虫的致病能力

2．3．3单核细胞增生李斯特菌和无害李斯特菌对线虫发育周期、寿命、产卵数和孵化率的影响

2．3．4线虫虫龄对单核细胞增生李斯特菌致病性的影响

2．3．5单核细胞增生李斯特菌喂饲线虫时，线虫体表、消化道和粪便中的细菌数

2．3．6用不同的细菌喂饲线虫时，线虫达到各个发育阶段所需时间

2．3．7线虫对食物的趋向性

2．3．8sigB测序结果及蛋白质结构分析

2．4讨论

第三章果蝇可作为研究单核细胞增生李斯特菌侵染机制的模型

3．1实验材料与设备

3．1．1菌株的培养

3．1．2果蝇培养及培养基的配制

3．1．3实验试剂

3．1．4实验设备

3．2实验方法

3．2．1确定适合培养果蝇以及单核细胞李斯特菌的培养基

3．2．2果蝇发育周期的检测

3．2．3细菌喂饲果蝇的产卵数的检测

3．2．4细菌喂饲果蝇的孵化率的检测

3．2．5细菌喂饲果蝇蛹鲜重、成蝇鲜重测量

3．2．6显微注射果蝇

3．2．7显微注射后果蝇体内的细菌数测量

3．2．8统计分析

3．3实验结果

3．3．2喂饲法检测单核细胞增生李斯特菌对果蝇的致病能力

3．3．3不同的细菌喂饲果蝇蛹鲜重、成蝇鲜重测量

3．3．4显微注射法检测单核细胞增生李斯特菌对果蝇的致病能力

3．3．5显微注射单核细胞增生李斯特菌后果蝇体内细菌增殖状况

3．4讨论

第四章一株蜡样芽胞杆菌的鉴定及毒性研究

4．1实验材料和设备

4．1．1秀丽隐杆线虫、果蝇及菌株

4．1．2实验试剂及配制

4．1．3实验设备

4．2实验方法

4．2．1形态学特征观察

4．2．2伴孢晶体蛋白鉴定

4．2．316S rDNA序列的分析

4．2．4细菌特异性毒力基因的鉴定

4．2．5生化鉴定

4．2．6利用秀丽隐杆线虫和果蝇为感染模型研究待检菌的致病性

4．3实验结果

4．3．1待测菌的菌落特征、芽孢和伴孢晶体蛋白

4．3．2生理生化鉴定结果

4．3．316S rDNA测定

4．3．4蜡样芽胞杆菌特异性毒力基因的检测结果

4．3．5利用秀丽隐杆线虫和果蝇为感染模型研究待检菌致病性的结果

4．4讨论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢