秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)col--119基因的表达及功能分析

摘要

胶原蛋白(Collagen)作为重要的结构蛋白在线虫生长发育过程中发挥着重要的作用。胶原蛋白序列在多细胞生物中具有很高的保守性。秀丽线虫（Caenorhabditis elegans）胶原蛋白家族有165个成员，目前根据胶原蛋白序列保守区结构的差异，将其分成5-6组。col-119属于胶原蛋白家族第3组成员，已有研究表明，col-119对脂肪有一定的调节作用。 本研究通过DNAMAN软件对线虫胶原蛋白家族其中的5组胶原蛋白序列（第1a组成员没有公布突变表型）和人类4种胶原蛋白疾病的蛋白序列进行多重序列比对，发现其在3组内成员间有很高的同源性，组间与dpy-2组的同源性最高，达46.23％，而与dpy-7组、2组、1组的相似性依次递减。与人类胶原蛋白COL1A1的相似性也达到39.42％。NJ进化树验证分析与多重序列比对得到相似的结果。 通过qRT-PCR，检测了卵期、L3期(larval stage3)、L4期(larval stage4）、成虫期的col-119基因表达量，结果显示，该基因在卵和成虫期高表达;与幼虫期L3和L4相比具有极显著差异(p＜0.01），卵期的表达量与成虫期相比达到显著性差异(p＜0.05)。 随后，通过RNAi(RNA interference，RNAi)抑制col-119基因的表达。qRT-PCR检测干扰结果显示，干扰效果十分明显。对干扰后表型的分析:(1)RNAi后线虫总产卵量(264±10)与对照组(256±10)相比差异不显著;(2)卵的孵化率（72.2±1％）与对照组（91.3±1％）相比有显著性降低(p＜0.01);(3)在统计孵化率的过程中，发现RNAi线虫排出卵部分异常，表现为卵壳脆弱或卵外形呈现出圆形或不规则形状，且异常卵数目(75±4)与对照组(25±3)相比数量明显增多，达到显著性差异(p＜0.05);(4)对线虫寿命统计发现该基因对线虫寿命无显著性影响，观察线虫运动轨迹及运动方式均正常;(5)红油O对脂肪染色及可作为脂肪标记的转基因虫株(dhs-3∷GFP::N2)验证发现RNAi线虫表皮及肠道中脂肪含量、脂滴大小、脂滴密度均明显降低，经ImageJ软件对虫体脂肪含量进行分析，实验组与对照组相比脂肪含量显著性降低(p＜0.01)。 最后，克隆基因上游3Kb序列与pPD95.75-GFP质粒载体构成融合质粒，显微注射到线虫体内，经荧光共聚焦显微镜观察，该基因在线虫全身表皮均有表达，且在生殖孔处有很强的荧光信号，但幼虫期很难观察到荧光信号，与该基因的时序表达图谱一致。 综上可知，col-19在卵和成虫期高表达，在成虫全身表皮均有表达。对线虫卵的孵化率、胚胎发育、脂肪代谢方面具有重要作用，但对线虫寿命、体长、运动能力等方面的影响不大。推测，参与了卵和成虫的表皮构建。本研究对秀丽线虫col-119基因的功能在时空表达、生殖、发育、脂肪代谢及运动能力等方面进行了全面的分析。完善了线虫col-119基因的表达及功能研究，对胶原蛋白家族的其它基因的功能研究具有一定的借鉴意义，同时COL-119蛋白与人类胶原蛋白有很高的同源性。同一个胶原蛋白基因有不同的突变方式，从而形成不同的突变表型。秀丽线虫胶原蛋白的研究对人类的胶原蛋白疾病的研究也具有一定的参考价值，同时秀丽线虫也可作为研究不同胶原蛋白突变的实验模型。

目录

声明

摘要

1、前言

1．1模式生物秀丽线虫的简介

1．1．1秀丽线虫

1．1．2秀丽线虫的繁殖与生活史

1．1．3秀丽线虫的表皮

1．2胶原蛋白研究

1．2．1秀丽线虫胶原蛋白的结构

1．2．2秀丽线虫胶原蛋白基因的遗传学

1．2．3秀丽线虫胶原蛋白家族

1．2．4胶原蛋白在其它物种中的研究

1．3 RNAi技术和显微注射技术

1．4研究目的及意义

2．1实验材料

2．1．1虫株、菌株和质粒

2．1．2主要试剂

2．1．3主要仪器

2．1．4溶液配制

2．1．5主要引物序列

2．2实验方法

2．2．1基因的序列分析

2．2．2基因的时空表达分析

2．2．3RNAi的实施

2．2．4组织表达定位

3．1序列分析

3．2基因col-119各时期的表达分析

3．3 RNAi实验分析

3．3．1目的基因的克隆

3．3．2干扰载体的构建

3．3．3干扰效果的荧光定量检测

3．3．4 RNAi后线虫卵的变化

3．3．5线虫产箩目量和孵化率

3．3．6线虫寿命、运动能力及表皮形态的变化

3．3．7脂肪染色分析

3．3．8脂肪转基因虫株的干扰分析

3．4线虫的组织定位

3．4．1目的序列的克隆

3．4．2融合载体的构建

3．4．3显微注射

4讨论

4．3col-119基因干扰后秀丽线虫脂肪含量降低

4．4线虫可作为研究人类胶原蛋白基因疾病的模型

4．5小结与展望

参考文献

致谢