棉花(Gossypium hirsutum)蓝铜蛋白BCP4在纤维细胞伸长中的功能研究

摘要

棉纤维作为一种天然纺织纤维，经现代纺织技术加工成的服装、家用棉制品等深受广大消费者的喜爱。但是，我国原有的棉花品种中，纤维品质参差不齐，无法满足市场对高产量、高品质棉纤维的需求。从可持续发展角度看，改善棉纤维品质迫在眉睫。随着现代生物技术的快速发展，通过克隆鉴定调控棉纤维发育的关键基因，研究棉纤维发育的分子调控机制，然后运用转基因技术较快获得优质棉品种，是目前常用的一种研究思路和育种方法。
　　蓝铜蛋白(Blue copper proteins，BCP)是一种Ⅰ型铜蛋白，最早发现于细菌中，其后发现BCP在生物界中广泛分布。研究表明，BCP在生物体内发挥重要功能，如电子传递、氧活化等。近来有研究表明，其对植物正常发育也起到重要的调控作用。GhBCP4(Genebank登录号:GU451702.1)是我们从陆地棉(Gossypium hirsutum)中分离得到的一种蓝铜蛋白，组织表达谱分析表明GhBCP4在开花后10天(10 days postanthesis，10DPA)的棉纤维中高度表达，暗示该基因在棉纤维伸长过程中可能发挥重要功能。拟南芥表皮毛与棉纤维（种皮毛）同属植物表皮毛范畴，一些研究结果表明在拟南芥表皮毛中异源表达棉纤维发育相关的基因，有助于理解该基因在棉纤维发育过程中的生物学功能。
　　本文从蛋白亚细胞定位、启动子分离及元件分析、转基因拟南芥和棉花的鉴定及表型分析等方面对GhBCP4在棉纤维伸长过程中的功能进行了研究探讨，主要结果如下:
　　1.GhBCP4蛋白亚细胞定位分析
　　构建了GhBCP4∷GF融合表达载体，转化农杆菌LBA4404，然后利用农杆菌介导的DNA转移来进行棉花遗传转化，获得转化的棉花愈伤组织细胞。挑取有GFP荧光的棉花愈伤组织细胞制片，在共聚焦显微镜下观察，发现GhBCP4蛋白不仅定位在细胞膜上，在细胞质中也有分布。
　　2.GhBCP4启动子克隆鉴定
　　了解GhBCP4上游调控序列有助于GhBCP4的功能研究，因此，根据已公布的棉花基因组序列，设计引物，利用PCR技术得到了GhBCP4的启动子序列。该序列长度为1985bp，通过PLACE和PlantCARE两个在线启动子预测软件进行元件分析，发现该启动子除具有基本启动子特征元件之外，还具有参与生长发育、抗逆应答等重要调控元件。
　　构建了GhBCP4Pro∷GUS融合表达载体，转化拟南芥，获得转基因植株。但是，对筛选得到的绿苗进行GUS染色，结果没有得到预期的显蓝信号，相关实验需要进一步验证。
　　3.GhBCP4过量表达转基因拟南芥表型分析
　　构建了GhBCP4过量表达载体，转化拟南芥，获得转基因植株。对转基因植株T2代纯化株系进行了GhBCP4基因表达量检测和表型分析。提取T2代植株叶片RNA，检测分析了不同转基因拟南芥植株中GhBCP4的表达量。选取表达量从高到低的3个株系，统计分析植株上第5/6/7片莲座叶表皮毛长度和数目，结果表明，与野生型相比，转基因拟南芥叶表皮毛增长增多，这说明GhBCP4过量表达能够促进表皮毛起始和发育。
　　4.GhBCP4转基因棉花鉴定及表型分析
　　1)CaV35S启动子驱动的GhBCP4 RNAi转基因棉花表型分析对所获得的GhBCP4 RNAi转基因棉花及其后代植株(T0、T1和T2代)进行鉴定，利用荧光实时定量PCR(Quatitative Real time PCR，Q-RT PCR)技术检测了转基因棉花株系中GhBCP4基因的表达量，结果表明RNAi转基因株系的棉纤维细胞中该基因的表达受到不同程度的抑制，其表达量显著低于野生型。而且，转基因棉花纤维发育受阻，成熟纤维长度较野生型明显变短。这说明GhBCP4基因在棉纤维发育中发挥重要调控作用。
　　2)RDL1启动子驱动的GhBCP4 RNAi的载体构建及转基因棉花植株鉴定
　　为了更好地揭示GhBCP4在棉纤维发育中的功能，克隆了棉纤维特异启动子RDL1p，构建RDL1p∷GhBCP4RNAi表达载体，用RDL1p驱动GhBCP4在棉纤维中特异表达。目前已得到7个胚性愈伤组织细胞系，其中大部分体细胞胚萌发出苗，获得大量的转基因棉花小苗(T0代)，移栽到大田中，生长发育至成熟。对这些转基因植株进行了鉴定和初步分析。
　　3)CaMV35S启动子驱动的GhBCP4过量表达(OE)转基因棉花植株鉴定除在拟南芥表皮毛中过量表达GhBCP4外，也构建了GhBCP4过量表达载体，进行棉花遗传转化，获得大量T0代转基因棉花植株，大多数植株生长发育正常。提取其基因组DNA，进行阳性鉴定，表明其中大多为阳性植株。这些转基因棉花的表型分析正在进行中。

目录

声明

摘要

一、引言

1．1 植物表皮毛发育及其调控机制

1．1．1 植物表皮毛的概述

1．1．2 拟南芥中的表皮毛

1．1．3 植物表皮毛发育的分子调控机制

1．1．4 棉花中的种子表皮毛

1．2 棉花纤维发育及其分子调控机制

1．2．1 棉纤维的概述

1．2．2 棉纤维发育的分子调控机制

1．3 蓝铜蛋白

1．3．1 蓝铜蛋白概述

1．3．2 植物蓝铜蛋白

1．4 立题依据及研究意义

二、材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 载体和菌种

2．1．3 化学试剂及工具酶

2．1．4 常用储液及试剂

2．1．5 常用缓冲液

2．1．6 常用培养基

2．1．7 常用试剂盒

2．1．8 PCR引物合成及测序

2．1．9 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 农杆菌介导的拟南芥、棉花的遗传转化

2．2．2 观察GFP荧光判断转基因愈伤细胞中GhBCP4的亚细胞定位

2．2．3 拟南芥基因组的提取

2．2．4 GhBCP4过量表达转基因拟南芥的鉴定

2．2．5 拟南芥总RNA的提取

2．2．6 RNA的消化及逆转录

2．2．7 拟南芥莲座叶表皮毛的表型统计及洗脱方法

2．2．8 高盐低渗法提取棉花基因组

2．2．9 RBL1启动子驱动的GhBCP4RNAi载体的构建

2．2．10 转基因棉花的鉴定

2．2．11 10DPA棉纤维材料的收取

2．2．12 10DPA棉纤维RNA的提取

2．2．13 棉花RNA的消化和逆转录

2．2．14 Q-RT PCR分析GhBCP4、GhBCP2在RNAi转基因棉花中的表达变化

2．2．15 GhBCP4启动子克隆鉴定

三、实验结果

3．1 GhBCP4蛋白亚细胞定位

3．2 GhBCP4启动子克隆鉴定

3．2．1 GhBCP4启动子分离及序列分析

3．2．2 GhBCP4启动子活性分析

3．3 GhBCP4过量表达转基因拟南芥的鉴定及表型分析

3．3．1 GhBCP4过量表达转基因拟南芥的鉴定

3．3．2 GhBCP4过量表达转基因拟南芥的表型分析

3．4 GhBCP4转基因棉花的鉴定及表型分析

3．4．1 CaMV 35S启动子驱动的GhBCP4 RNAi转基因棉花的表型分析

3．4．2 RDL1启动子驱动的GhBCP4 RNAi载体的构建及棉花遗传转化

3．4．3 CaMV35s启动于驱动的GhBCP4过量表达转基因棉花鉴定

四、讨论

4．1 GhBCP4蛋白亚细胞定位

4．2 GhBCP4启动子序列中的顺式作用元件分析

4．3 GhBCP4促进棉纤维细胞的伸长发育

4．4 GhBCP4促进棉纤维伸长的可能调控机制

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢