猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和伪狂犬病ELISA抗体检测方法及PRRSV弱毒活疫苗研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)和伪狂犬病(Pseudorabies,Pr)分别由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)和伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PrV)引起以母猪繁殖障碍和仔猪死亡为主要特征的病毒性疾病,给全球养猪业造成了巨大的经济损失.为使PRRS和Pr能得到及时准确地诊断,也为PRRS的预防提供安全有效的疫苗,从而达到更有效地控制疾病的目的,因此,进行该研究,研究内容如下:⒈兔抗猪IgG的酶标记.⒉酶联免疫吸附试验(ELISA)检测猪伪狂犬病血清抗体.⒊猪繁殖与呼吸综合征病毒膜基质蛋白基因和核衣壳蛋白基因的克隆和原核表达.⒋检测PRRSV血清抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法的建立.⒌猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗研究.

目录

第1章文献综述

1.1猪繁殖与呼吸综合征

1.1.1猪繁殖与呼吸综合征及其危害

1.1.2猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原学特征

1.1.3 PRRSV的分子生物学研究进展

1.1.4猪繁殖与呼吸综合征发病机制及病理变化

1.1.5猪繁殖与呼吸综合征的流行病学

1 1.6猪繁殖与呼吸综合征的免疫学

1.1.7猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展

1.1.8猪繁殖与呼吸综合征诊断方法研究进展

1.2伪狂犬病

1.2.1伪狂犬病及其危害

1.2.2伪狂犬病的病原学

1.2.3伪狂犬病病毒的致病机理与病理变化

1.2.4伪狂犬病的临床症状与流行病学

1.2.5伪狂犬病病毒的免疫学

1.2.6伪狂犬病的根除

1.2.7伪狂犬病诊断方法研究进展

第2章高效价酶标记兔抗猪IgG的研制

2.1研究目的和意义

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果与分析

2.3.1猪IgG浓度

2.3.2家兔血清内抗猪IgG效价

2.3.3兔抗猪IgG的纯化

2.3.4兔抗猪IgG浓度

2.3.5兔抗猪IgG-HRP的质量鉴定

2.3.6兔抗猪IgG-HRP的保存期

2.3.7与同类产品的的比较

2.4 讨论

2.4.1猪IgG的纯度

2.4.2家兔的选择和免疫

2.4.3兔抗猪IgG-HRP的质量鉴定

2.4.4兔抗猪IgG-HRP的保存

2.5小结

第3章酶联免疫吸附试验(ELISA)检测猪伪狂犬病血清抗体的研究

3.1研究目的和意义

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3结果与分析

3.3.1 PrV溶液灭活的检测

3.3.2 PrV抗原蛋白浓度

3.3.3 PrV抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度

3.3.4 ELISA阴阳性判定标准的确定

3.3.5 ELISA的敏感性

3.3.6 ELISA的特异性

3.3.7 ELISA的重复性

3.3.8 ELISA的初步应用

3.3.9 PrV抗体检测ELISA试剂盒的稳定性

3.4 讨论

3.4.1 ELISA最佳抗原包被浓度和血清最佳稀释度的选择

3.4.2增殖伪狂犬病病毒细胞的选择

3.4.3 ELISA的初步应用

3.4.4 PrV抗体检测ELISA试剂盒

3.5小结

第4章猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白基因和核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达研究

4.1研究目的和意义

4.2材料与方法

4.2.1材料

4.2.2方法

4.3结果与分析

4.3.1 PRRSV的TCID50测定结果

4.3.2 ORF6和ORF7片段的扩增

4.3.3重组质粒pTN1、pTN2和pTM的酶切鉴定

4.3.4重组质粒pTN1、pTN2和pTM的序列测定

4.3.5重组质粒pTNM的酶切鉴定

4.3.6重组质粒pGEX-KGN和pGEX-KGNM的酶切鉴定

4.3.7表达产物的SDS-PAGE检测和Western blot分析

4.4 讨论

4.4.1 ORF6和ORF7克隆表达的应用前景

4.4.2 ORF7的克隆与原核表达

4.4.3 ORF7与ORF6的融合表达

4.5小结

第5章酶联免疫吸附试验(ELISA)检测猪繁殖与呼吸综合征血清抗体方法的建立

5.1研究目的和意义

5.2材料与方法

5.2.1材料

5.2.2方法

5.3结果与分析

5.3.1重组蛋白的浓度测定

5.3.2抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度

5.3.3 ELISA阴阳性判定标准

5.3.4 rN-ELISA和rNM-ELISA的特异性

5.3.5 rN-ELISA和rNM-ELISA重复性

5.3.6 rN-ELISA、rNM-ELISA与美国ELISA试剂盒的比较

5.3.7 rNM-ELISA试剂盒的稳定性

5.4讨论

5.4.1 N蛋白和M蛋白的特征及其在PRRS诊断上的价值

5.4.2重组蛋白的提取

5.4.3 rN-ELISA和rNM-ELISA方法的建立

5.4.4 rN-ELISA、rNM-ELISA与IDEXX ELISA试剂盒的比较

5.4.5 PRRSV抗体检测rNM-ELISA试剂盒

5.4.6 ELISA操作中的注意事项

5.5小结

第6章猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗研究

6.1研究目的和意义

6.2材料与方法

6.2.1材料

6.2.2方法

6.3结果与分析

6.3.1 MARC-145细胞的培养

6.3.2 PRRSV增殖条件

6.3.3冻干前与冻干后毒价的比较

6.3.4冻干弱毒活疫苗的保存期试验

6.3.5 PRRSV弱毒活疫苗的安全性试验

6.3.6 PRRSV克隆20株的免疫原性

6.4 讨论

6.4.1我国的PRRS现状与防制

6.4.2 PRRSV冻干疫苗的生产

6.4.3 PRRSV冻干疫苗的安全性

6.4.4 PRRSV冻干疫苗的免疫原性

6.5小结

参考文献

缩略词表

附录

致谢