透明颤菌血红蛋白基因在弗氏链霉菌中的克隆与表达

摘要

弗氏链霉菌是泰乐菌素的产生菌,它严格好氧,其发酵液由于较粘稠而导致溶氧较差,因此溶氧成为泰乐菌素产量提高的限制性因素之一.该研究旨在通过在弗氏链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白基因(vhb)来改善氧的传递,进而改善菌体生长,提高泰乐菌素的产量.pIJ8600是能整合于链霉菌染色体的表达载体,其含有链霉菌噬菌体oC31整合性位点,并拥有能被硫链丝菌素诱导的强启动子(P<,tipA>).将vhb基因置于P<,tipA>之下,构建成vhb基因表达载体pWQ2005,通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移导入弗氏链霉菌中,PCR验证表明vhb基因成功整合到染色体上,经硫链丝菌素诱导后,CO结合差光谱分析显示,pWQ2005表达出有生物活性的VHb蛋白.摇瓶发酵实验初步证实,VHb蛋白的表达可明显促进泰乐菌素的合成与菌体的生长,但不同诱导时间产生的作用效果差异显著.pSET152与pIJ8600属同一类型的载体,但其不含用以表达外源基因的启动子;该研究利用其构建成含自身启动子的vhb基因表达载体pWQ1116,但vhb基因在限氧条件下却未在弗氏链霉菌中表达,这可能是弗氏链霉菌的RNA聚合酶不能识别该启动子.红霉素抗性基因启动子(P<,ermE>)是能在链霉菌中组成型表达的强启动子.应用SOE-PCR(Splicing of Overlap Extension by PCr)将不含自身启动子的vhb基因置于P<,ermE>之下,利用P<,ermE>表达vhb基因.为使vhb基因在弗氏链霉菌中更好的表达,对其进行了定点诱变,构建成经诱变的vhb基因表达载体pWQ2004和pWQ1023,并构建成未诱变的vhb基因表达载体pWQ1118作对照;CO结合差光谱分析显示,三者在弗氏链霉菌中均表达出有生物活性的透明颤菌血红蛋白(VHb),但与对照相比,经诱变的vhb基因表达量有所提高.候选接合子(Streptomyces fradiae/p WQ2004)经初筛后,进行的摇瓶与5L罐发酵结果初步显示,VHb蛋白的表达显著促进泰乐菌素合成与菌体的生长,这种作用越是在限氧条件下,表现的越是明显.

目录

略缩语

第一章 文献综述

1.1透明颤菌血红蛋白及其基因的研究进展

1.1.1前言

1.1.2透明颤菌血红蛋白及其基因的早期研究

1.1.3透明颤菌血红蛋白高级结构的研究

1.1.4透明颤菌血红蛋白作用机理的研究

1.1.5 nhb基因的克隆及其表达调控机制

1.1.6透明颤菌血红蛋白及其基因的应用研究

1.2泰乐菌素及其基因工程的研究进展

1.2.1前言

1.2.2泰乐菌素生物合成的研究

1.2.3泰乐菌素生物合成的分子生物学研究

1.2.4泰乐菌素的结构改造

1.3本研究的立题依据及目的意义

第二章 材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株

2.1.2质粒

2.1.3 PCR引物

2.1.4培养基与溶液

2.1.5仪器设备

2.2实验方法

第三章 弗氏链霉菌的培养特征与vhb基因诱导型表达载体的构建及应用

3.1前言

3.2结果与分析

3.2.1弗氏链霉菌的培养特征

3.2.2 vhb基因诱导型表达载体的构建及应用

3.2.3 vhb基因氧调控表达载体的构建及应用

3.2.4 vhb基因在E. coli BL21(DE3)中的表达

3.3小结与讨论

第四章 vhb基因组成型表达载体的构建及应用

4.1前言

4.2结果与分析

4.2.1 vhb基因达载体的构建

4.2.2 vhb基因(pWQ2004)在弗氏链霉菌中的整合及表达

4.2.3 vhb的表达对弗氏链霉菌菌体生长与泰乐菌素合成的影响

4.3小结与讨论

第五章 总结与展望

5.1总结

5.2展望

参考文献

致谢