猪琥珀酸脱氢酶D亚基基因的单核苷酸多态性检测、表达谱研究、辐射杂种板定位及性状关联分析

摘要

养猪业是畜牧业的一个重要产业,通过分子遗传学途径对猪的遗传机理进行研究可加深对猪基因的结构、功能及与性状关系等的了解,推动动物育种理论的发展以及为猪育种工作提供更多的可作为标记辅助选择(marker assisted selection,MAS)的候选基因.该研究主要对猪琥珀酸脱氢酶D亚基(succinate dehydrogenase complex,subunit D,SDHD)基因第四外显子中的单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphisms,SNPs)进行检测,并在通城试验猪群中进行突变位点与性状的关联分析,利用辐射杂种板对该基因进行染色体定位以及对该基因的表达谱研究.取得以下研究结果:1.以猪胚胎期骨骼肌cDNA文库测序获得的猪SDHD基因cDNA序列设计特异引物,分离该基因第四外显子中部分片段;2.对所分离的基因片段进行SSCP检测,挑选不同的SSCP纯合型的具有代表性的个体进行PCR产物测序,发现在SDHD基因Exon4中的CDS区存在两个SNP位点,两个SNP位点中有一个引起了氨基酸的改变,但无内切酶位点,另一个SNP位点的突变为同义突变,存在一个MboI酶切位点;3.在无亲缘相关群体中分别进行SSCP检测和使用MboI进行RFLP检测,并对各自的基因型进行了基因频率计算和基因在群体中分布的显著性检验,结果表明:基因频率和基因型频率在不同猪品种中的分布存在不同的差异显著性;4.在通城试验猪群中进行RFLP检测,将RFLP基因型与该试验猪群中的部分性状进行了关联分析,发现猪SDHD基因MboI酶切位点的SNP与眼肌面积显著相关(P=0.0067),与肌肉大理石纹的相关接近显著(P=0.0614);5.以通城猪和鄂西黑猪的肾、心、脾、肺、肝五个组织进行该基因的表达谱研究,结果表明该基因在所检测的各个组织中均有表达.6.利用辐射杂种板将猪SDHD基因定位在猪染色体9p21.

目录

摘要

ABSTRACT

前言

1.后基因组学与猪基因组的研究

2.单核苷酸多态性(SNP)的研究进展及其应用

2.1单核苷酸多态性的特点

2.2单核苷酸多态性的检测方法

3.琥珀酸脱氢酶(SDH)与及其亚基的功能意义

3.1琥珀酸脱氢酶(SDH)的生理功能

3.2琥珀酸脱氢酶(SDH)突变的病理学意义

3.3琥珀酸脱氢酶亚基的特点与功能

3.4猪SDHD基因以及SDH其它亚基的研究现状

4.研究目的和意义

4.1本研究的目的

4.2本研究的意义

材料与方法

1.试验材料

1.1样品

1.2主要仪器设备

1.3主要试剂

1.4主要试剂的配制

1.5主要分子生物学软件

2.试验方法

2.1猪SDHD基因CDS区域寻找SNP引物的设计

2.2 PCR反应

2.3 SNP的检测

2.4RT-PCR进行SDHD基因组织表达谱研究

2.5 IMpRH杂种板定位

结果

1猪SDHD基因cDNA序列的分析

2.SDHD基因Exon4中序列的分离

2.1目的片段分离结果的初步鉴定

2.2目的片段分离的进一步确定与SNP候选位点的鉴定结果

3.SDHD基因的SNP检测与性状关联分析

3.1 SSCP基因型及基因频率分析

3.2 RFLP基因型及基因频率分析

3.3 RFLP不同基因型与部分生产性状的关联分析

4.猪SDHD表达谱研究结果

4.1总RNA的质量

4.2猪SDHD基因表达谱初步分析结果

5.SDHD基因IMpRH的染色体精细定位结果

5.1定位引物扩增的分型结果

5.2猪SDHD基因的RH定位结果

讨论

1.关于CDS区未知SNP的检测策略

2.SSCP、RFLP以及直接测序法检测SNP的比较

3.关于基因频率在猪群间的分布差异与基因——性状关联分析

4.表达谱研究的分析

5.定位结果的讨论

小结

1.主要研究结果

2.本研究的特色与创新点

3.本研究的不足之处

参考文献

致谢

附录1猪SDHD基因cDNA全长

附录2主要性状的中英文对照和缩写

附录3密码子表

附录4 SSCP检测的试剂配制与实验步骤