利用离体培养技术筛选魔芋软腐病抗源材料的研究

摘要

魔芋软腐病是由胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜软腐亚种(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora)引起的重要病害，此病一旦发生对魔芋生产造成严重威胁，且难以根除。由于魔芋种质资源贫乏，生产上可利用的抗病品种相对少，目前关于本病的防治，主要是通过农业技术措施和化学药剂控制，但因本病侵染来源和传播途径较广，现有的技术措施往往难以达到理想的防病效果。 随着植物离体培养技术和突变体鉴定方法的改进，利用此项技术方法筛选抗病突变体已成为植物细胞工程的重要研究领域。本研究试图利用离体培养技术筛选魔芋软腐病抗病突变体，进而获得人工组培再生植株，旨在为生产实践应用奠定基础。 本课题以魔芋顶芽、顶芽鳞片、侧芽、皮上芽苞、拟块茎鳞片为外植体，不同外植体在各自最适培养基上诱导。结果表明：拟块茎鳞片形成愈伤组织平均诱导率高达90.6％，形成的愈伤组织在分化培养基上进行不定芽诱导，魔芋拟块茎鳞片不定芽的诱导率为96.4％，繁殖系数为4.9；而其它外植体最高的不定芽诱导率为74.2％，繁殖系数为4.1。由此可见魔芋拟块茎鳞片是最佳诱导愈伤组织的外植体。 在抗病突变体的筛选过程中，本研究用3种不同的方法处理愈伤组织：(1)以不同浓度的甲基磺酸乙酯(EMS)对魔芋不同分化程度的愈伤组织进行处理。离体筛选结果表明，用浓度为0.4％的EMS处理预培养4d的材料，平均存活率为47.2％。因此，以浓度为0.4％的EMS处理预培养4d的一批愈伤组织，将处理后存活的材料扩繁，同时与未经EMS处理的材料分别用针刺法接菌，进行魔芋抗软腐病突变体的筛选；将接菌筛选存活的愈伤组织分化，获得了19株再生植株。(2)利用细菌滤液筛选魔芋软腐病抗病突变体。将愈伤组织接种在含60％的魔芋软腐病菌滤液培养基上培养1个月，转接到普通培养基上缓和培养1个月，如此反复转接8次后，存活的愈伤组织接菌，然后接到分化培养基上，获得5株再生植株。(3)直接接菌法筛选魔芋抗软腐病突变体。配制9个不同浓度的魔芋软腐菌菌悬液直接接种愈伤组织，随着时间的推移，发现愈伤组织都被迅速大量繁殖的菌体和其分泌物覆盖，接菌浓度对所处理的愈伤组织侵染之间没有多大区别。本试验接种的愈伤组织在3周后全部死亡。 对普通继代植株和普通继代过程中表型发生变异的植株，EMS诱变后接菌筛选获得的植株和细菌滤液处理获得的植株进行过氧化物酶(POD)同工酶、超氧化物歧化酶(SOD)同工酶、多酚氧化酶(PPO)同工酶的酶谱比较分析。 POD同工酶研究结果表明：细菌滤液处理和EMS诱变后接菌筛选获得的植株表现特有的3条酶带，分别是Rf0.14、Rf0.18、Rf0.23，而用EMS诱变后接菌筛选的植株表现出1条Rf0.51特有酶带。不同筛选方法获得的植株所表现的特有酶带可能与抗软腐病有关。 SOD同工酶研究结果表明：除用EMS诱变后接软腐菌筛选的植株有1条特异酶带Rf0.40，本研究所取样的4种植株SOD同工酶酶带集中在Rf0.53～0.65之间，各酶带迁移率非常接近，表明各同工酶的分子量大小相差不是很大。 PPO同工酶研究结果表明：细菌滤液和用EMS诱变后接菌筛选植株所特有的新酶带在Rf0.36～0.61之间。该酶带区的迁移率跨度较大，这可能与抗病性筛选所获得的植株PPO同工酶分子量发生变化有关。

目录

文摘

英文文摘

本文出现的主要缩略词

文献综述

1.魔芋软腐病

1.1魔芋软腐病病害发生危害与传播

1.2魔芋软腐病病原生物学

1.3魔芋软腐病流行原因分析

1.4魔芋软腐病综合防治

2.植物离体培养技术与作物育种

2.1植物组织培养技术的研究进展

2.2植物组织培养中的形态建成

2.3植物组织培养技术的应用

2.4离体培养技术在抗病突变体筛选方面的应用

3.诱变与组织培养相结合在植物育种中的应用

3.1细胞的辐射敏感性分析

3.2体细胞无性系变异与变异体选择

4.病原-寄主互作的研究进展

4.1植物-病原物互作的概念

4.2植物的抗病性研究

4.3植物抗病性中防御酶的作用

5.本研究的目的与意义

1.材料

1.1形成愈伤组织的魔芋不同外植体

1.2利用甲基磺酸乙酯(EMS)筛选魔芋软腐病抗源材料

1.3利用细菌滤液和直接接菌法筛选魔芋软腐病抗源材料

1.4提取酶液的再生植株

2.方法

2.1获得最佳的外植体材料

2.2魔芋软腐病抗病突变体的筛选

2.3同工酶分析

1.获得最佳的外植体材料

1.1魔芋不同外植体愈伤组织的诱导

1.2愈伤组织继代与芽点的分化

1.3幼苗的生根与移栽

2.魔芋抗软腐病材料的筛选

2.1 EMS筛选魔芋抗软腐病的材料

2.2细菌滤液筛选魔芋抗软腐病材料

2.3直接接菌筛选魔芋抗软腐病材料

3.对获得的再生植株同功酶分析

3.1过氧化物酶(POD)谱带的变化

3.2超氧化物歧化酶(SOD)谱带的变化

3.3多酚氧化酶(PPO)谱带的变化

1.魔芋不同外植体诱导愈伤组织的形成

2.魔芋抗病突变体的筛选

2.1利用EMS筛选魔芋抗软腐病的材料

2.2利用细菌滤液筛选魔芋抗软腐病的材料

2.3直接接菌筛选魔芋抗软腐病的材料

3.对获得的再生植株同功酶分析

4.进一步研究设想

参考文献

附录

致谢