TFG种子的杀虫活性和有效成分研究

摘要

本研究以豆科植物TFG为材料,以主要的储粮害虫谷蠹、玉米象、杂拟谷盗、锯谷盗为试验对象,对粗提物和分离物的触杀、驱避活性进行了跟踪测定,系统研究了溶剂和提取方法对粗提物触杀、驱避活性的影响,比较了提取率和生物活性的差异,客观评价了与提取效率及杀虫活性相关的因子在提取分离过程中的作用,并确立了一种用于提取TFG生物活性物质的最优方案,分离出其中所含的活性成分,鉴定出其化学结构,最后进一步研究了活性单体的作用。主要研究结果如下:
　　 1.以无水乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、石油醚为溶剂采用温浸回流法对TFG种子中的生物活性物质进行提取。用乙醇作溶剂时,对TFG的提取率最高,为11.48％,TFG的石油醚提取率最低,只有4.91％。TFG的氯仿提取率、乙酸乙酯提取率和丙酮提取率分别为7.24％、7.54％和5.29％。
　　 生物测定结果表明:TFG的5种溶剂粗提物对玉米象成虫都表现出一定的驱避作用。氯仿温浸粗提物对玉米象的驱避效果最好,在剂量为1000μg/cm2的驱避级别达到Ⅱ级,在处理剂量为5000μg/cm2时,驱避级别达到Ⅲ级,其次是丙酮粗提物,在处理剂量为1000μg/cm2时对玉米象的驱避级别达到Ⅱ级。
　　 2.以TFG种子干粉为原料,以无水乙醇为提取溶剂,采用冷浸法、温浸法、索氏法、冷浸-索氏法、超临界CO2萃取法(SCFE)对TFG粗提物的提取方法进行了比较研究,SCFE法的提取率为11.35％,高于冷浸法(4.65％)和冷浸-索氏法(8.14％),略低于索氏法(12.99％),和温浸法(11.48％)的提取率基本持平。
　　 5种方法得到的粗提物对杂拟谷盗都表现出良好的驱避性,不同粗提物的有效驱避剂量差异显著,其中,超临界CO2萃取物试验所用剂量最小,由初试结果将最高剂量拟定为0.16mg/cm2,其平均的驱避率为87.9％,驱避级别为Ⅴ级,第1天的驱避效果很显著,驱避率为96.6％,到第4天仍有明显的驱避效果；温浸法粗提物效果也较好,当粗提物剂量为0.96mg/cm2～1.6mg/cm2,处理后每天的驱避率都超过了80％,而平均驱避率更是超过了90％,驱避级别均在Ⅴ级。冷浸法、索氏法、冷浸-索氏法得到的粗提物的驱避效果相对较差,因而测试剂量最大,最高剂量设为16mg/cm2,是超临界CO2萃取物试验测试剂量的100倍。
　　 5种方法得到的各粗提物对玉米象都有较好的触杀效果,很小的剂量即可导致玉米象大量死亡。通过对各个时间段所得到的致死中量进行比较,发现超临界CO2萃取物对玉米象的触杀效果最好,处理玉米象24h、48h、72h后的致死中量分别为0.252mg/cm2、0.232mg/cm2、0.166mg/cm2,与其它方法相比,剂量均为最低。
　　 5种方法得到的各粗提物对杂拟谷盗的致死中量从小到大依次为温浸法、SCFE法、冷浸法、冷浸.索氏提取、索氏提取法。SCFE法得到的粗提物对杂拟谷盗的触杀活性除了在前三天的观察中略低于温浸法粗提物,在转入饲料中饲喂一周后,其对杂拟谷盗的LD50与温浸法相当,在处理剂量为0.91mg/cm2时,杂拟谷盗72h后的死亡率达到了90％,在剂量高于0.52mg/cm2时,10d后的死亡率均在80％以上。
　　 5种方法得到的各粗提物对谷蠹的致死活性依次为温浸法>SCFE技术>冷浸法>索氏提取法>冷浸-索氏提取法。温浸法和SCFE法得到的TFG粗提物对谷蠹有良好的触杀活性,处理谷蠹24h后的LD50分别为0.255mg/cm2和0.256mg/cm2,48h后的LD50分别为0.144m/cm2和0.156mg/cm2,72h后的LD50分别为0.112mg/cm2和0.142mg/cm2,10d后的LD50分别为0.100mg/cm2和0.130mg/cm2。
　　 3.以3种溶剂乙醇、乙酸乙酯、氯仿作为夹带剂,对TFG种子干粉进行SCFE,TFG种子粗提物萃取得率由高到低的顺序依次为:乙醇>乙酸乙酯>氯仿>无夹带剂,分别为14.17％、13.31％、10.74％和10.18％。
　　 以乙醇作为夹带剂时,所得到的超临界CO2萃取物对玉米象的触杀活性最强,对玉米象处理24h,48h,72h后的LD50分别为231.764μg/cm2,194.43μg/cm2,141.06μg/cm2；乙酸乙酯作夹带剂时,得到的萃取物对玉米象的触杀效果也较好,对玉米象处理24h,48h,72h后的LD50分别为228.67μg/cm2,180.09μg/cm2和152.61μg/cm2,触杀效果较弱的是氯仿作为超临界CO2萃取的夹带剂时得到的萃取物,效果最差的是不选用夹带剂,用单一的超临界CO2作为溶剂而萃取得到的萃取物,处理玉米象72h后的LD50最大,为218.74μg/cm2。
　　 不同夹带剂萃取得到的各萃取物对杂拟谷盗成虫的触杀活性的大小依次为氯仿>乙醇>无夹带剂>乙酸乙酯,处理杂拟谷盗10d后的LD50分别为278.57μg/cm2、303.89μg/cm2、341.74μg/cm2和429.45μg/cm2。
　　 4.以萃取率作为目标函数,通过考察分析萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂体积和夹带剂浓度对萃取率的影响趋势,确定超临界CO2萃取过程中各影响因素的正交试验条件为:操作压力的正交试验区间为20MPa～30MPa；萃取温度的正交试验区间为45℃～55℃；正交试验的操作时间为1.5h；正交试验夹带剂用量的区间为20mL～40mL；正交试验夹带剂浓度的区间为60％～95％。
　　 选择TFG萃取物的触杀活性作为主要的评判指标,同时以TFG萃取物萃取得率作为补充评判指标,以正交试验对TFG超临界CO2进行工艺优化,试验结果表明:最佳萃取工艺为萃取压力25Mpa,萃取温度55℃,夹带剂为95％乙醇,固液比为200g:30mL。
　　 5.用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水依次对TFG超临界CO2萃取物(简称TFG-1)进行萃取,萃取率分别为61.32％、9.22％、9.16％、8.39％和17.08％。生物测定结果表明:TFG-1的活性成分主要存在于石油醚萃取物中,对谷蠹成虫表现出很强的触杀作用,TFG-1石油醚萃取物对谷蠹处理24h、48h、72h和10d后的LD50分别为175.05μg/cm2、133.65μg/cm2、113.37μg/cm2和79.34μg/cm2。氯仿萃取物对谷蠹的触杀活性较强,乙酸乙酯萃取物具有一定的活性,而正丁醇萃取物和水提取物未见杀虫活性。
　　 以不同极性的溶剂系统作为展开剂,将TFG-1石油醚萃取物进行薄层层析(TLC),在紫外光(254nm)下进行观察,未见明显谱带。说明TFG-1石油醚萃取物没有紫外吸收现象。当以石油醚:乙酸乙酯=10:1的混合溶剂作为展开剂时展层效果最好,在碘显色时有5个谱带,在磷钼酸显色时有10个谱带,其Rf值在0.1-0.9之间。
　　 将TFG-1石油醚萃取物进行柱层析,第1次柱层析后,经TLC检测,归类合并,共得到7个流分,第1个组分(Ⅰ)的得率最高,为75.13％,是TFG-1石油醚萃取物的主要成分。当载药量均为519.95μg/cm2时,只有流分Ⅰ的杀虫效果最明显,对谷蠹的致死率在24h时即达到100％,流分Ⅵ其次,对谷蠹的致死率在24h时为80.76％,另外流分Ⅴ也有较好的杀虫效果,对谷蠹的致死率在24h时为46.67％,而流分Ⅱ、Ⅳ和Ⅶ的杀虫效果较差,流分Ⅲ几乎没有杀虫效果。
　　 流分Ⅰ柱层析分离得到5个样品,分别为样品a、样品b、样品c、样品d、样品e,其中样品e为流分Ⅰ的主要成分。流分Ⅵ柱层析分离后得到4个样品,分别为样品f、样品g、样品h、样品i,其中样品i为流分Ⅵ的主要成分。生物测试结果显示从流分Ⅰ中得到的5个样品均有杀虫活性,样品e对谷蠹成虫的触杀活性很强,当处理剂量为259.98μg/cm2时,谷蠹经样品e处理后,其24h时的死亡率达77.78％。从流分Ⅵ中得到的4个样品同样均有杀虫活性,样品i的触杀活性较强,谷蠹经剂量为259.98μg/cm2的样品i处理,其24h后的死亡率为41.11％。
　　 6.化合物Ⅰ对谷蠹成虫有较强的触杀活性,剂量为129.99μg/cm2的药剂处理试虫24h、48h、72h和10天后,谷蠹的平均死亡率分别为32.22％、40.00％、56.67％和70.00％,死亡率较高。化合物Ⅰ对玉米象有明显的触杀效果,用剂量为129.99μg/cm2的药剂处理试虫24h、48h、72h和10天后,玉米象的平均死亡率分别为86.67％、92.22％、95.56％和100.00％,死亡率很高。
　　 化合物Ⅱ对谷蠹和玉米象的触杀效果相对较弱,当药膜剂量为259.98μg/cm2时,对谷蠹处理10天后有少量成虫死亡,平均死亡率为4.44％,同样的剂量处理玉米象10天后的平均死亡率为97.78％。
　　 将化合物Ⅰ与化合物Ⅱ按质量比为1:1制成混剂,对谷蠹和玉米象的生测结果表明:处理谷蠹成虫10天后,得到的共毒系数为60.57,共毒系数数值小于80,两单体的活性在处理谷蠹成虫10天后表现为拮抗作用,混剂处理玉米象10天后,得到的共毒系数为30.23,共毒系数数值小于80,两单体对玉米象的活性同样表现为拮抗作用。

目录

文摘

英文文摘

课题来源

缩略语表

引言

1.1 植物杀虫剂防治储粮害虫的历史、发展与现状

1.2 本研究的目的和意义

第一章 豆科杀虫植物与豆科植物TFG研究概况

1 豆科杀虫植物研究概况

1.1 豆科杀虫植物的分布及其分类

1.2 豆科杀虫植物的化学成分与生物活性

2 TFG研究概况

2.1 TFG的资源分布和生物学特性

2.2 TFG的药用价值

2.3 TFG的化学成分

第二章 TFG不同溶剂粗提物对主要储粮害虫的生物活性

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 TFG在不同溶剂中的提取率

2.2 TFG不同溶剂粗提物对4种储粮害虫的驱避作用

2.3 TFG不同溶剂粗提物对4种储粮害虫的触杀活性

3 小结与讨论

第三章 不同提取方法对TFG提取物生物活性的影响

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对TFG种子的提取率

2.2 不同提取方法制备的TFG种子粗提物驱避活性研究

2.3 不同提取方法制备的TFG种子粗提物触杀活性研究

3 小结与讨论

第四章 夹带剂对SCFE法萃取TFG生物活性物质效能的影响

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 不同夹带剂对CO2超临界(SCFE)萃取得率的影响

2.2 TFG-SCFE萃取物对3种储粮害虫的触杀作用

3 小结与讨论

第五章 正交试验优选TFG超临界CO2萃取条件研究

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 超临界CO2萃取TFG种子正交试验参数的确定

2.2 超临界CO2萃取TFG活性成分正交试验

2.3 正交试验各因素对萃取得率和触杀活性的影响

2.4 适宜的超临界CO2萃取工艺条件

2.5 正交试验结果的验证试验

3 小结与讨论

第六章 TFG超临界CO2萃取物的有效杀虫成分的分离与鉴定

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 TFG-1各萃取物得率及触杀活性

2.2 TFG-1石油醚萃取物的分离纯化

2.3 有效杀虫成分化学结构鉴定

3 小结与讨论

附图

第七章 TFG单体化合物生物活性研究

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 化合物Ⅰ的触杀作用

2.2 化合物Ⅱ的触杀作用

2.3 化合物Ⅰ与化合物Ⅱ混剂的触杀作用

3 小结与讨论

本研究取得的重要成果及创新点

参考文献

致谢