‘无核瓯柑’、温州蜜柑无核的细胞及分子机理研究

摘要

柑橘雄性不育是导致柑橘果实无核的主要原因之一。本实验对细胞质雄性不育柑橘品种‘国庆一号’温州蜜柑小孢子发育过程进行了研究，并克隆到几个可能与胞质雄性不育相关的线粒体基因，应用RT-PCR、Northern杂交和RNA原位杂交技术对这些线粒体基因在花药发育过程中的时空表达情况进行研究。此外对‘瓯柑’突变品种‘无核瓯柑’以及其他一些不育或低育柑橘品种，应用细胞学、组织化学等手段对它们的不育原因进行了初步研究。主要研究结果如下： 1、对普通‘瓯柑’及其无核突变体的花粉形态及育性进行观察和测定，发现两者的花粉粒外观结构相同，花粉量相近；但普通‘瓯柑’成熟花粉的KI-I<,2>和FDA染色活力分别为84.5％和71.4％，而‘无核瓯柑’均为0；这说明花粉败育是导致‘无核瓯柑’无核的主要原因。 采用半薄切片对普通‘瓯柑’和‘无核瓯柑’的小孢子发育过程进行了对比观察，发现‘无核瓯柑’几乎全部的四分体都表现出异常。采用压片法对‘无核瓯柑’的四分体时期进行观察，发现存在着从单分体、二分体、三分体、四分体一直到七分体等各种情况的异常现象，而且在每个异常的四分体中，小孢子的大小极不均一，从而导致最后形成的花粉粒也极不一致，其花粉粒的直径从10μm到30μm不等；而普通‘瓯柑’中皆为正常的四分体。这进一步说明减数分裂异常是导致‘无核瓯柑’花粉败育的主要原因。 组织化学检测发现，普通‘瓯柑’成熟花粉粒中含有大量淀粉粒，而‘无核瓯柑’花粉中很少；普通‘瓯柑’成熟花粉粒表面积累的脂类物质也比‘无核瓯柑’多；因而推测淀粉、多糖等营养物质积累的不足可能是‘无核瓯柑’花粉不能萌发的主要原因之一。 2、对‘国庆一号’温州蜜柑花粉育性和果实种子数进行了调查，发现其花粉醋酸洋红染色活力为35％，萌发活力为零，说明其花粉是完全不育的；‘国庆一号’温州蜜柑自然状态下平均每果种子数为1粒，而当用枳花粉对其进行授粉后发现，其平均每果种子数增加到4粒。花粉败育是导致‘国庆一号’温州蜜柑无核的主要原因。 采用半薄切片对‘国庆一号’温州蜜柑小孢子发育过程进行了观察并将这一过程划分为4个时期，即小孢子母细胞形成期、小孢子母细胞减数分裂期、花粉粒形成期和花粉败育期；并确定了小孢子的败育时期最早出现在减数分裂期，但其大量败育主要发生在小孢子从四分体中释放出来之后的花粉发育早期。花粉母细胞减数分裂行为观察发现，其减数分裂行为中期I不正常比例只占16.9％，后期I全部正常，说明其减数分裂基本正常，进一步证实了‘国庆一号’小孢子的败育时期主要发生在减数分裂之后的花粉发育早期。而TUNEL检测发现，在‘国庆一号’温州蜜柑花粉败育时期的花药绒毡层细胞中检测到DNA损伤信号；同时在四分体时期的母细胞中也出现DNA损伤，并且在从四分体中释放出来的小孢子中大量检测到DNA损伤信号。说明在‘国庆一号’温州蜜柑的绒毡层和小孢子发育过程中可能存在着细胞程序性死亡现象。 3、根据线粒体基因的高度保守区段序列设计引物，从‘国庆一号’温州蜜柑中扩增得到三个线粒体基因片段Citatp6，Citcob和CitcoxⅡ，序列比对分析发现它们与其他10余种植物中的atp6，cob和coxⅡ基因分别具有85％，98％和96％的同源性；Southem杂交发现它们在柑橘中为多拷贝。 RT-PCR和Northern杂交发现Citatp6，Citcob和Citcoxll的表达模式相似，都是在‘国庆一号’温州蜜柑叶片和减数分裂时期的花蕾中大量表达；Citcob只产生一个转录本，而Citatp61和CitcoxⅡ产生两个转录本。RNA原位杂交结果进一步表明Citatp6、Citcob和CitcoxⅡ表达规律相似，在花粉母细胞中的表达很低，在花粉母细胞减数分裂时期表达不断增强，四分体时期的小孢子母细胞中达到最强，在释放的小孢子中逐渐减弱，在成熟以及败育的花粉中不再表达；在绒毡层中的表达也具有特异性，也是在四分体时期达到最高，在小孢子形成时期显著降低，最后在成熟以及败育的花粉时期检测不到表达。推测线粒体基因在‘国庆一号’温州蜜柑花药中的特异性表达可能改变了其雄配子发育过程的线粒体呼吸状态，进而导致其雄性不育。 4、采用细胞学、组织化学等方法对四个不同育性柑橘品种‘耐湿脐橙’、‘国庆一号’、‘华农本地早’橘和‘HB’柚进行了对比研究。研究发现‘耐湿脐橙’只形成胞原细胞，随后开始降解，以致花药败育无花粉产生；其他品种小孢子都经历减数分裂过程形成花粉粒，但不育品种‘国庆一号’在小孢子从四分体中释放出来后大量败育；组织化学检测发现在可育成熟花粉中含大量淀粉粒，花粉表面积累大量脂类物质，而不育花粉相应积累较少；对不同时期花药POD同工酶电泳发现，在不育和低育品种‘耐湿脐橙’、‘国庆一号’、‘华农本地早’橘花药发育早期POD活性最强，而在可育品种‘HB’柚中的活性最低，说明POD同工酶可能与柑橘雄性不育相关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章文献综述

1植物雄性不育研究进展

1.1植物雄性不育概况

1.2细胞核雄性不育

1.3细胞质雄性不育

1.4植物雄性不育的细胞生物学研究进展

2柑橘雄性不育及无核机理研究进展

2.1柑橘无核品种的选育情况

2.2柑橘雄性不育的主要类型

2.3柑橘无核机理的研究进展

3植物RNA原位杂交技术的发展和应用

3.1 RNA原位杂交技术的原理

3.2 RNA原位杂交技术的发展历史

3.3 RNA原位杂交技术在植物基因表达研究中的应用

3.4 RNA原位杂交技术的应用前景

4本研究的目的、意义及主要研究内容

第二章‘瓯柑’及其无核突变体花药结构与组织化学研究

1引言

2材料与方法

2.1实验材料

2.2方法

3结果与分析

3.1花粉育性

3.2小孢子发育

3.3小孢子发育过程中的组织化学检测

3.4花粉粒的扫描电镜形态

4讨论

4.1‘无核瓯柑’无核的原因

4.2‘无核瓯柑’花粉败育的时期及其无核机理的探讨

第三章‘国庆一号’温州蜜柑小孢子发育及线粒体基因时空表达研究

1引言

2材料与方法

2.1材料和试剂盒

2.2方法

3结果与分析

3.1花器官形态学观察

3.2花粉育性及种子数调查

3.3小孢子发育

3.4花粉母细胞减数分裂行为观察与统计

3.5花药DNA损伤的TUNEL检测

3.6 atp6、cob和coxⅡ的克隆及序列分析

3.7 Citatp6、Citcob和CitcoxⅡ的Southern印迹分析

3.8 Citatp6、Citcob和CitcoxⅡ的RT-PCR分析

3.9 Citatp6、Citcob和CitcoxⅡ的Northern印迹分析

3.10 Citatp6、Citcob和CitcoxⅡ的时空表达分析

4讨论

4.1温州蜜柑小孢子发育过程的分期

4.2温州蜜柑花粉败育的时期

4.3绒毡层与雄性不育的关系

4.4温州蜜柑小孢子发育过程的细胞程序性死亡

4.5柑橘线粒体基因的克隆

4.6温州蜜柑雄性不育分子机理的探讨

第四章不同育性柑橘品种花器官结构、组织化学及同工酶分析

1引言

2材料与方法

2.1实验材料

2.2方法

3结果与分析

3.1花粉活力及花器官形态学观察

3.2小孢子发育

3.3小孢子发育过程中的组织化学检测

3.4同工酶分析

4讨论

参考文献

图版和说明

附录

致谢