菌核病菌诱导甘蓝型油菜差异表达Rsk基因的初步分析

摘要

本文以抗(耐)菌核病显著强于中油821的中R-888作供体亲本，中油821作受体亲本和回交亲本所创建的甘蓝型油菜近等基因系为材料，克隆了菌核病菌诱导差异表达基因的全长，分析了近等基因系之间在不同生长时期以及不同部位间该基因的表达。主要结果如下： 筛选并初步鉴定了采用cDNA-AFLP方法分离出的与抗菌核病相关的差异表达片段40-2。对其进行BLAST序事列比对分析，推测其基因表达产物属于富含亮氨酸蛋白重复家族。利用RT-RACE方法对有效差异片段40-2进行全长cDNA扩增，得到总长为1707bp的cDNA序列，包含有完整的Polv(A)尾巴结构和5'端的非翻译区。登录Genbank，注册号DQ983911。 通过BLASTx序列比对分析该序列与拟南芥中的抗病/富含亮氨酸重复的蛋白质家族的mRNA同源性最高达87％，序列相似性分析还发现其基因表达产物与拟南芥中一个与蛋白质结合有关的激酶有很高的同源性达62％，并且该cDNA序列具有保守的LRR-RI区域，推测其有可能是核糖核酸酶抑制子亚家族成员。目前在油菜中还未发现与该序列同源的基因与蛋白质。推测其有可能是油菜中的一个与抗病相关的LRR蛋白质家族成员。 以中油821基因组为模板，根据差异片段40-2全长cDNA序列设计一对引物进行PCR扩增，得到40-2基因组DNA全长。测序结果表明该基因组DNA全长1685bp，预测为一个基因，编码区在264-1586bp之间，具有一个外显子，没有内含子。登陆GenBank，注册该基因名字为Rsk(Sclertiorum Resistanct Kinase gene)，登录号为DQ983911。 它的开放阅读框在264bp-1586bp，长度达1323bp，编码一个由440个氨基酸残基组成的蛋白质。编码的蛋白质在GenBank上的登录号为ABl99471，它包含了20种常见的氨基酸，其中亮氨酸含量最多。该蛋白分子量为48.308KD，等电点为5.35，为一个酸性蛋白质。其蛋白质两端具有亲水性，中间具有疏水性，含有一个跨膜结构域。二级结构预测发现该蛋白质含有最多的是随机卷曲(Random coil)结构，其次是a-螺旋(Alpha helix)和延伸链(Extended strand)结构。在290-313的氨基酸残基处具有一个LRR结构域，在蛋白质接近C-端处具有一个跨膜结构域，C-端末尾部分位于细胞溶质内。从其结构特征推测，该蛋白可能定位于细胞膜上。 以中油821×中R888 BC<,5>的基因组DNA为模板，同样条件扩增的产物测序结果表明该基因组DNA全长1703bp，基因组DNA序列预测为一个基因，编码区在264-1604bp之间，具有一个外显子，没有内含子。登陆GenBank，获得登陆号为EF623492。比对分析结果显示，在中油821×中R-888 BC<,5>中扩增的：DNA序列的1-1577、1596-1703处都能与中油821中的Rsk基因序列重合，但是在第1573-1595位的18个碱基在中油821中的Rsk基因中是缺失的。即在中油821中克隆的Rsk基因全长与中油821×中R-888 BC5中克隆出的对应基因的全长相比，前者缺失了18个碱基。推测在基因水平上的碱基缺失差异很有可能与近等基因系之间的抗(耐)菌核病的差异有关。中油821×中R-888 BC<,5>中克隆的基因序列推测编码446个氨基酸残基，从N端开始到438以及两者最后的两个氨基酸都是相同的，中油821×中R-888 BC5在439-444处多出6个氨基酸，其余部分完全重合。该结果与DNA)芋列的比对结果相吻合。推测它可能就是在接种菌核病后的近等基因系之间产生表达差异的遗传基础。 Rsk基因在抗(耐)菌核病不同的品种(系)和近等基因系中油821和中油821×中R-888 BC5的不同发育期，不同组织都有一定的表达，且品种(系)间没有太大差异。在菌核病菌最适生长部位的花瓣中该基因表达较强，苗期叶片以及抽苔期的叶片中表达较低。

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文摘

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论文说明：缩略词表

声明

第一章文献综述

1油菜菌核病

2植物抗病防御机制

2.1植物抗病防御机制的种类

2.2植物防御反应的信号传导途径

3植物抗病相关基因研究进展

3.1植物抗病基因的类型、结构与功能

3.2植物抗病基因的克隆方法

4研究目的和意义

5研究内容

第二章实验部分

1前言

2材料与方法

2.1供试材料

2.2试验方法

3实验结果与分析

3.1苗期抗性鉴定结果

3.2 RNA的提取结果

3.3测序与序列分析

3.4 40-2的3'RACE-PCR扩增结果

3.5 40-2的5'RACE-PCR扩增结果

3.6 40-2基因组全长扩增结果

3.7序列结构分析

3.8 RSK基因的组织表达相对定量结果

4讨论

4.1蛋白激酶与植物抗病的关系

4.2菌核病菌诱导甘蓝型油菜差异表达的基因

附录

参考文献

致谢