芥菜型油菜细胞质雄性不育hau CMS的研究

摘要

油菜是世界上重要的油料作物之一，油菜杂种优势已得到广泛应用，而细胞质雄性不育是油菜杂种优势最重要的途径。芥菜型油菜hau细胞质雄性不育是傅廷栋教授于1999年在华中农业大学发现的，通过回交转育已获得了稳定的油菜细胞质雄性不育系。本研究从育性调查、细胞学观察、恢保关系分析以及分子水平鉴定等方面对芥菜型油菜细胞质雄性不育hauCMS(Cytoplasmicmalesterility)进行综合遗传分类；在遗传分类的基础上，通过线粒体DNA位点和RNA表达水平的差异分析，初步进行了hauCMS不育分子机理研究；利用hauCMS不育的稳定性，将不育细胞质转育到甘蓝型油菜和芸薹属十字花科蔬菜中；同时进行了恢复基因的筛选。主要研究结果如下： 1.对芥菜型油菜细胞质hau不育系00-6-102A在武汉和兰州进行了6年12个回交世代的育性观察，hauCMS的不育性稳定彻底，雄蕊通常败育为小花瓣。不育株率和不育度均为100％，且不受环境条件的影响；将芥菜型细胞质转移到甘蓝型油菜6-W301和6-W307中，获得了同样稳定的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系。 2.在所有320份测交材料中，用14个来源不同的甘蓝型油菜已知恢复系、保持系材料分别与hau、pol、nap、ogu、tour等5种CMS进行恢保关系测定，鉴定测交Fl的育性，结果表明：hauCMS与nap、pol、ogu、tour胞质不育型具有明显不同的恢保关系。 3.制作石蜡切片对hauCMS不育系00-6-102A和保持系00-6-102B进行了细胞学显微结构观察，hauCMS的花药败育发生于雄蕊原基分化时期。其特点是，败育时期很早，没有孢原细胞的分化，6枚雄蕊都败育为小花瓣，雄蕊偏离正常的分化轨道。HauCMS的花药败育特点明显不同于以前研究过的油菜胞质不育类型(如ogu、pol、nap、tourCMS等)。 4.用10个线粒体基因的40个探针/酶组合进行RFLP分析，总共有16个探针/酶组合(atp6/HindIII、atp6/EcoRI、atp6/EcoRV、atp9/BamHI、atp9/EcoRI和atp1/BamHI等)可以将hauCMS与pol、nap、ogu、tourCMS区分开。其中，5个探针/酶组合(atp1/BamHI、atp6/BamHI、orf222/EcoRI、Orf263-atp6/EcoRI、orf222/HindIII)能将5个CMS彼此区分开，可以作为鉴定油菜细胞质类型的标记使用。RFLP分析结果进一步证明，hauCMS在线粒体DNA水平上与pol、nap、ogu、tour不育胞质不同，是一种新的油菜不育胞质类型。 5.在hauCMS育性分子机理研究方面，通过已经公布的甘蓝型油菜品种westar线粒体基因组序列和拟南芥线粒体基因组序列，PCR扩增获得34个油菜线粒体探针，对hauCMS不育系00-6-102A和保持系进行Realtime-PCR和Northernblot分析，结合线粒体DNA水平上的位点差异，获得6个可能与hauCMS不育相关的线粒体基因，经过PCR-walking和序列分析，其中位于atp6基因下游的一个新的开放阅读框orf288可能是与hauCMS密切相关的线粒体基因，其与已经公布的主要油菜细胞质雄性不育的基因区域不同。 6.通过杂交和回交已将hau不育细胞质转移到芸薹属十字花科蔬菜(白菜、榨菜、雪里蕻、包心芥和红菜薹)中，获得稳定的蔬菜雄性不育系，且不育株率和不育度均为100％。 7.用不同来源的320份芥菜型、甘蓝型油菜、埃芥及种间杂种与不育系测交，目前还未找到完全恢复的材料，只有2份部分恢复的材料，但还需要进一步测定。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1文献综述与开题设想

1.1引言

1.2植物细胞质雄性不育的研究进展

1.2.1高等植物线粒体基因组特点和CMS相关基因区域

1.2.2植物细胞质雄性不育恢复基因的定位和克隆

1.2.3恢复基因对CMS的调控机理

1.2.4细胞质雄性不育相关基因的克隆研究

1.2.5展望

1.3油菜细胞质雄性不育的不育性与育性恢复性的研究进展

1.3.1油菜细胞质雄性不育的分类

1.3.2油菜细胞质雄性不育性的分子生物学研究

1.3.3展望

1.4开题设想

2芥菜型油菜细胞质雄性不育hau CMS的育性鉴定和恢保关系研究

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1实验材料

2.2.2育性鉴定

2.2.3不育度和不育株率的鉴定

2.2.4转育hau CMS的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系

2.2.5恢保关系的分析

2.3结果与分析

2.3.1 hau细胞质雄性不育系育性调查和雄性不育系花器官形态观察

2.3.2芥菜型油菜hau CMS的不育度和不育株率的鉴定

2.3.3转育hau CMS的甘蓝型油菜雄性不育系

2.3.4恢保关系的分析

2.4讨论和结论

3 hau CMS败育特点的解剖学研究

3.1前言

3.2实验材料与方法

3.2.1实验材料

3.2.2取样与制样

3.2.3普通光镜观察

3.3结果与分析

3.3.1保持系的花药形态与发育

3.3.2芥菜型油菜细胞质雄性不育系00-6-102A花药的形态和发育

3.3.3 8-602A(tour CMS)花药的形态和发育

3.4讨论与结论

4 hau CMS不育类型的分子鉴定

4.1前言

4.2实验材料与方法

4.2.1试验材料

4.2.2 CTAB法提取基因组总DNA

4.2.3油菜黄化苗线粒体的分离和线粒体DNA的提取

4.2.4制备线粒体探针

4.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备

4.2.6目的片段与T载体的连接与转化

4.2.7重组子筛选、鉴定

4.2.8克隆片段的测序

4.2.9 RFLP分析

4.2.10特异引物的设计与PCR分析

4.3结果分析

4.3.1 RFLP结果分析

4.3.2特异引物的PCR反应的结果与分析

4.4讨论与结论

5 hau CMS的分子机理研究

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1实验材料

5.2.2 PCR扩增获得油菜线粒体基因片段

5.2.3 mtDNA RFLP检测00-6-102A和00-6-102B的多态性

5.2.4总RNA的提取

5.2.5 Realtime PCR

5.2.6 Northern blot分析

5.2.7染色体步行

5.2.8测序和BLAST分析

5.2.9 RT-PCR分析

5.3结果与分析

5.3.1 mtDNA水平上的差异

5.3.2 Realtime PCR反应结果

5.3.3 Northern blot分析

5.3.4差异基因的染色体步行结果

5.3.5序列分析

5.3.6四个线粒体基因在00-6-102A和00-6-102B之间的RT-PCR表达差异分析

5.4讨论与结论

6十字花科芸薹属蔬菜雄性不育的转育

6.1前言

6.2实验材料与方法

6.2.1实验材料

6.2.2 MS培养基的配制

6.2.3胚挽救技术的方法

6.2.4染色体鉴定F1杂种

6.3结果与分析

6.3.1白菜不育系的选育

6.3.2榨菜、雪里蕻和包心芥菜雄性不育系的选育

6.4讨论与结论

参考文献

附录

附表

博士期间的主要成果、文章

致 谢