甘蓝型油菜硼高效近等基因系的构建及硼高效基因BnBE2的定位

摘要

硼是高等植物生长发育所必需的矿质元素。甘蓝型油菜是需硼较多的作物，对硼缺乏比较敏感。我国油菜主产区土壤普遍缺硼，缺硼导致油菜“花而不实”，大量减产。农业生产上主要依赖增施硼肥解决耕地缺硼问题，然而硼是不可再生的矿质资源。不同甘蓝型油菜品种的硼效率性状存在显著差异，而且受遗传控制，这为硼效率性状的遗传改良提供基础。我们课题组在筛选获得甘蓝型油菜硼效率种质资源的基础上，开展硼高效基因的初步定位工作，研究表明甘蓝型油菜硼效率受多个基因控制。为了精细定位和克隆甘蓝型油菜硼高效基因，本论文建立了营养液培养条件下甘蓝型油菜苗期硼效率的鉴定体系，以甘蓝型油菜苗期硼效率性状为基础，采用随机的分子标记辅助背景选择构建了硼高效近等基因系；并在此基础上开展了硼高效位点BnBE2的定位研究，主要获得以下结果： 1.甘蓝型油菜苗期硼效率鉴定体系的建立 在不同硼水平的营养液培养条件下，调查不同基因型甘蓝型油菜苗期的生长势，结果表明在大量和微量元素分别采用优级纯和分析纯化学试剂、营养液母液和工作液均用去离子水配制(>12MΩ)时，在0.25μMB水平下不同基因型甘蓝型油菜的生长势表现出明显的差异，硼高效基因型生长较好，而硼低效基因型植株矮小且表现出明显的缺硼症状。该鉴定体系不但适合不同基因型甘蓝型油菜品种苗期硼效率的鉴定，也适合分离群体各单株硼效率差异的研究，其实验条件易控制，重复性好。 2.甘蓝型油菜硼高效近等基因系的构建 在营养液培养条件下(0.25μMB)，通过连续四代回交，且在每一回交世代的苗期进行硼效率鉴定，采用分子标记对回交世代中硼高效单株进行遗传背景辅助选择，构建了甘蓝型油菜硼高效近等基因系。并证明在回交过程中采用随机分子标记辅助背景选择的有效性和必要性，且适宜在回交早世代进行。 3.硼高效基因的定位 3.1回交群体中硼效率性状的遗传分析 采用营养液培养(0.25μMB)对回交分离群体苗期硼效率性状进行调查，根据I18株系的BC4S1，BC5和BC6三个回交分离群体中高、低效单株的分离比例，表明I18株系的硼效率性状受单个孟德尔因子控制。该株系中目标位点纯合的单株与轮回亲本组成了一对硼高效近等基因系，可供开展硼高效基因的精细定位和克隆、以及硼高效位点生理功能等的研究。 3.2硼高效基因连锁标记的筛选与定位 在I18株系的BC5回交群体苗期硼效率鉴定的基础上，以极端硼效率表型分组构建了近等基因池，结合AFLP和SRAP分子标记技术，筛选到6个与目标基因连锁的分子标记。利用BC6、TNDH和BQDH两个双单倍体遗传群体对连锁标记进行定位，结果表明目标基因位于甘蓝型油菜N14连锁群上，该硼高效位点被命名为BnBE2。对这些连锁的分子标记进行测序并与Brassica数据库中的序列进行BLAST分析，发现与连锁标记序列高度同源的克隆均来自甘蓝(Brassicaoleracea)，从侧面证明了本实验定位结果的可靠性。 3.3连锁的AFLP标记向SSCP标记的转化 将与目标基因连锁的AFLP标记S6M32的序列在Brassica数据库进行比对，发现它与甘蓝的一个BAC克隆BOHZW41高度同源，根据目标片段的侧翼序列设计引物，将该AFLP标记成功地转化为SSCP标记；证明了该转化标记方法的可行性。通过对该SSCP标记的片段测序并采用软件RNAstructure3.2对该SSCP标记的序列进行二级结构预测，发现两个亲本之间因为3个碱基的差异导致了构象的改变，并揭示了产生该SSCP标记的理论依据。 3.4利用比较作图发展连锁标记 甘蓝型油菜的基因组由A、C基因组组成，分别起源于白菜和甘蓝，且甘蓝与白菜基因组间序列具有高度同源性，将不同亲本构建的甘蓝型油菜遗传图谱A4上的3个SSR标记定位在C4上，且与目标基因BnBE2连锁。 4.硼高效基因BnBE2的生理功能 比较I18株系的硼高效回交单株(BC4S1,BC5)以及硼高效亲本青油10号和硼低效亲本Bakow在0.25μMB水平条件下硼吸收累积、生物学产量等性状，推测该株系硼高效QTL位点的硼高效生理基础可能为硼利用高效。 5.连锁标记与甘蓝型油菜硼效率的关联分析 通过分析目标基因BnBE2侧翼的连锁分子标记在不同硼效率甘蓝型油菜品种中的带型，发现该连锁标记的多态性与硼效率表型没有较好的相关性，进一步证明甘蓝型油菜硼效率是一个受多基因位点控制的复杂性状。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1.文献综述

1.1硼的植物生理功能

1.1.1缺硼与植物形态变化

1.1.2硼与细胞壁的结构和功能

1.1.3硼与植物激素代谢和顶端优势

1.1.4硼与酚类物质代谢

1.1.5硼与细胞膜的结构和功能

1.1.6硼与碳水化合物代谢及硼的运输

1.1.7硼与植物生殖器官的建成和发育

1.1.8硼与植物生物固氮

1.2植物硼营养高效的可能机制

1.2.1植物硼营养的遗传资源及遗传潜力

1.2.2植物硼营养性状相关基因的定位，克隆与表达

1.2.3植物硼营养遗传改良展望

1.3植物分子标记的发展

1.3.1分子标记的定义

1.3.2植物分子标记的种类

1.3.3植物分子标记的应用

1.3.4植物分子标记的开发

1.4分子标记辅助选择的研究进展

1.4.1MAS的优越性

1.4.2MAS的应用实例

1.5质量性状的分子标记

1.6植物比较基因组作图

1.6.1植物比较遗传作图

1.6.2植物比较物理作图

1.6.3植物比较作图的意义

1.7 DNA单链二级结构预测与单链构象多态性分析的一致性研究

2本研究的意义和目的

2.1研究意义

2.2研究基础

2.3研究目的

2.4研究内容

2.5技术路线

3甘蓝型油菜苗期硼效率鉴定体系的建立

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论

4甘蓝型油菜硼高效近等基因系的构建与基因定位

4.1甘蓝型油菜硼高效近等基因系的构建

4.1.1材料与方法

4.1.2结果与分析

4.1.3讨论

4.2甘蓝型油菜硼高效近等基因系的遗传基础

4.2.1材料与方法

4.2.2结果与分析

4.2.3讨论

4.3甘蓝型油菜硼高效基因BnBE2的定位

4.3.1材料与方法

4.3.2结果与分析

4.3.3讨论

4.4 DNA单链二级结构预测与单链构象多态性分析的一致性研究

4.4.1材料与方法

4.4.2结果与分析

4.4.3讨论

4.5连锁标记与甘蓝型油菜硼效率的关联分析

4.5.1材料与方法

4.5.2结果与分析

4.5.3讨论

5甘蓝型油菜硼高效位点BnBE2的硼高效生理特征

5.1材料与方法

5.2结果与分析

5.3讨论

6总结与展望

6.1总结

6.2本研究的主要创新点

6.3本研究不足之处

6.4下一步工作设想

参考文献

致谢

附录

作者简介、研究生期间论文发表