猪骨骼肌差异表达基因CMYA1及其同一家族成员CMYA4和CMYA5的克隆、定位与功能研究

摘要

我国猪育种的目标集中在生长、胴体、肉质、繁殖和抗病性状的改良上，猪肉产品的数量和质量的提高一直是猪育种工作的重点。中国地方品种与西方引入品种在生长速度、胴体瘦肉率、肌肉品质等性状上存在较大差异，这种表型上的差异应是由遗传差异所造成的。为了揭示造成这种差异的分子遗传机制，本实验室前期利用mRNA差异显示技术(mRNA differential display, DD)筛选存在于中外两个代表品种一二花脸与杜洛克成年猪背最长肌组织中差异表达EST，发现其中一条新EST在杜洛克中的表达量明显高于二花脸。本研究利用该EST信息，通过生物信息学方法分析该EST对应于人CMYA1(Cardiomyopathy associated1)基因。CMYA1基因隶属CMYA基因家族，该家族共有5个成员。本论文选取其中3个基因(CMYA1、CMYA4和CMYA5)，开展了猪新基因的克隆、定位及其功能的初步研究，得到如下结果：
　　 1、以mRNA差异表达EST为基础，结合生物信息学、比较基因组学以及RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术，利用RT-PCR实验分离、克隆、验证并获得了猪CMYA1基因完整的cDNA序列以及基因组DNA序列；获得了猪CMYA4基因包含完整编码区序列的部分cDNA序列；获得了猪CMYA5基因部分cDNA序列。
　　 2、利用ORF finder软件推导了猪CMYA1、CMYA4和CMYA5基因的氨基酸序列，并利用MotifScan软件预测了它们的结构域与功能。其中，猪CMYA1基因含有位于氨基端的DNA结合结构域，羧基端的SH3结合结构域以及16个氨基酸的重复序列。
　　 3、利用RH(radiation hybrid)克隆板对猪CMYA1、CMYA4和CMYA5基因进行了染色体定位，结果表明CMYA1基因定位于SSC13q，与Sw344紧密连锁(LOD值为10.19); CMYA4基因定位于SSC12，与Sw62紧密连锁(LOD值为18.07);CMYA5基因定位于SSC2q21-24，与Sw1602紧密连锁（LOD值为6.74）。
　　 4、利用RT-PCR方法检测了CMYA1、CMYA4和CMYA5三个基因在长白猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、骨骼肌、小肠、胃及脂肪组织中的表达情况，结果显示这3个基因都只在心肌和骨骼肌中特异表达。
　　 5、运用荧光实时定量PCR，分析了CMYA1基因在通城和长白不同发育时期（胚胎33天，65天，90天）骨胳肌的表达情况。结果显示CMYA1基因在胚胎发育的不同时期呈上调表达模式，在33天左右表达量很低，在随后65天至90天左右表达量逐渐升高。该基因在长白3个时期的表达量都明显高于通城猪。在胚胎发育的65天和90天，该基因的表达量在两品种中均存在显著差异(P＜0.05)。
　　 6、对CMYA1、CMYA4和CMYA5三个基因进行了SNP扫描，结果发现：
　　 1)CMYA1编码区中存在6个SNPs(C1053T、A1275G、A1394G、A1751G、 C3171T和C3290A)，其中3个位点(A1394G、A1751G和C3290A)碱基突变引起氨基酸的改变（分别为精氨酸-组氨酸、天冬氨酸-甘氨酸和苏氨酸-天冬氨酸）；
　　 2)CMYA4基因第15内含子A558G突变
　　 3)CMYA5基因编码区A7189C突变，该突变引起氨基酸由异亮氨酸变成亮氨酸。
　　 7、利用PCR-RFLP方法分别检测了CMYA1、CMYA4和CMYA5三个基因共计8个SNPs在杜洛克、大白、长白、通城、清平、江西玉山黑、大花白、二花脸和小梅山等中外9个品种中的基因型分布，同时进行了遗传学分析。卡方检验结果表明，这8个SNPs位点的基因型频率在不同品种间存在不同程度的差异。
　　 8、在我室与通城县畜牧局合作组建的试验猪群中，利用PCR-RFLP方法检测上述8个SNP的基因型，采用SAS（视窗V8版）GLM(General Linear Models)程序对其中6个SNPs位点与经济性状进行了初步的关联分析。结果显示，CMYA1基因编码区HinfI-RFLP(C1053T)位点与6-7肋骨间背膘厚以及最后肋骨处背膘厚存在显著关联(P＜0.05);Bsp143Ⅱ-RFLP(A1275G)与第10肋骨背膘厚以及肌内脂肪含量存在显著关联(P＜0.05);HaeⅢ-RFLP(A1751G)与平均背膘厚以及最后肋骨处背膘厚存在显著关联(P＜0.05)；RsaI-RFLP(C3290A)与平均背膘厚存在显著关联(P＜0.05);CMYA4基因MspI-RFLP(A558G)与6-7肋间膘厚以及肩膘存在显著关联(P＜0.05)；CMYA5基因BspTI-RFLP(A7189C)与腿臀比率存在显著关联(P＜0.05)。结果表明3个新基因是影响肌肉产品产量和质量的候选基因。
　　 9、利用CMYA1基因编码区HaeⅢ-RFLP(A1751G)位点，在美国Max.F Rothchild教授及其同事用2头巴克夏公猪与9头大自母猪交配产生525头F2代资源群体中检测了猪CMYA1基因与QTL连锁定位情况，结果显示该基因与位于13号染色体上影响背膘厚的QTL的侧翼标记Sw344紧密连锁(Rec=0.02;LOD=129.47)。
　　 本研究结果表明，CMYA基因家族成员在骨骼肌生长发育及肌肉品质形成中起重要作用，对该基因家族的深入研究为猪生长和肉质性状候选基因的筛选提供依据，为分子标记辅助育种提供DNA标记。