根瘤菌共生信号在豆科植物百脉根中的传递及其作用机制的研究

摘要

根瘤菌与豆科植物能形成一种特殊的共生体根瘤。根瘤菌与宿主植物共生体系的建立过程涉及到两者之间复杂的信号识别、基因表达调控、能量物质的交换等。根瘤菌与宿主植物之间的分子对话首先是在低氮或缺氮的环境下，宿主植物分泌一种类黄酮类化合物或相关化合物，该类物质能诱导根瘤菌一系列结瘤基因(nod)的表达并合成根瘤菌信号分子—结瘤因子(Nodfactor)。结瘤因子反过来引起宿主植物根毛发生卷曲，侵入线的形成，开启与根瘤形成和发育相关基因的表达，直至根瘤成熟。然而，根瘤菌结瘤因子信号在宿主植物中的传递过程及其调控机制还不清楚，本文以模式豆科植物—百脉根(Lotusjaponicus)共生固氮体系为材料，利用生物化学及分子生物学研究技术，开展了根瘤菌共生信号在宿主植物中传递途径和作用机制的研究。其主要研究结果如下： 1.利用酵母双杂交技术鉴定了百脉根结瘤因子受体Lj-NFR1、Lj-NFR5(NFR：Nodfactorreceptorkinase)、共生受体激酶Lj-SymRK(SymRK：SymbiosisReceptor-likeKinase)、离子通道蛋白CASTOR等共生功能蛋白间的相互关系。结果表明，这几个蛋白质在酵母双杂交技术条件下并无相互作用。 2.以接种百脉根根瘤菌2天、4天、6天、8天、12天的百脉根植株的根组织混合物为材料，抽提总RNA，利用RT-PCR合成cDNA，构建了百脉根AD-cDNA酵母双杂文库。其库容量达到2.5x106克隆/3μgDNA，其外源DNA片段大小为0.5-2.0kb。 3.SymRK基因编码一个类受体激酶蛋白。它由富含亮氨酸重复序列结构域(LRR，Leucinerichrepeat)，中间的跨膜结构域(Transmembrane)，C-末端的蛋白激酶结构域(PK，Proteinkinase)所组成。本研究分别以百脉根SymRK蛋白的LRR结构域和PK结构域为诱饵，筛选百脉根酵母双杂交AD-cDNA文库，得到了15种不同类型的与百脉根结瘤因子信号转导途径相关的基因。其中包括SIP1(SYmRK-interactingprotein)基因。根据Blast及生物信息学分析，SIP1蛋白质第126到第217氨基酸残基为ARID结构域，该结构域由8个α-螺旋和2个β-折叠组成。 4.通过酵母双杂交以及免疫共沉淀等方法对SIP1蛋白与SymRK-PK蛋白相互作用的研究表明，SIP1与SymRK-PK蛋白相互作用的区域定位于SIP1蛋白C-末端，其蛋白N端和ARID结构域均不能与SymRK-PK相互作用。对SIP1蛋白自身相互作用的研究结果表明，SIP1蛋白能形成同源二聚体，而且，SIP1蛋白通过自身C-末端的184个氨基酸残基相互作用形成同源二聚体，其N-末端的223个氨基酸残基不参与对二聚体的形成。 5.通过酵母单杂交以及凝胶阻滞的方法，我们证实SIP1蛋白具有结合DNA的能力，但是它没有转录激活的功能，由此确定SIP1蛋白为一个具有DNA结合功能的转录因子。SIP1蛋白能结合起始结瘤基因(NIN，noduleinception)基因的启动子序列，不能结合百脉根钙离子结合蛋白(CBP1，calcium-bindingprotein1)基因的启动子序列，这一结果说明NIN蛋白是SIP1蛋白所调控的下游基因。我们截去NIN基因启动子的-59到-70区域的序列后，SIP1蛋白不能与NIN基因启动子剩余区域结合，这一结果表明NIN基因启动子-59到-70区域的序列是SIP1蛋白结合NIN基因启动子区域的关键序列。 6.利用RealtimeRT-PCR检测了SIP1和NIN基因在百脉根中的表达，结果显示SIP1在百脉根不同组织(根、茎、叶)中均有表达，但是接种根瘤菌使其表达量显著增加。而NIN基因在百脉根中的表达则明显受到接种根瘤菌的影响，在接种根瘤菌5h后NIN基因的表达量就会倍增。 7.利用基因枪轰击使SIP1-红色荧光(Ds-Red)融合蛋白导入洋葱表皮细胞，瞬间表达结果显示，SIP1蛋白的细胞中定位于细胞核。SymRK-PK和SIP1蛋白的相关激酶活性实验表明，SIP1蛋白并不是SymRK蛋白的磷酸化底物。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

1前言

1.1生物固氮的概念和意义

1.1.1豆科植物根瘤的形成过程

1.1.2根瘤菌中参与结瘤的基因

1.1.3结瘤因子

1.1.4豆科植物中的结瘤因子信号转导途径

1.2植物中的受体蛋白激酶

1.3 ARID蛋白家族

1.3.1 ARID蛋白家族的分类

1.3.2 ARID结构域的结构

1.3.3 ARID家族蛋白的生物学功能

1.4蛋白质相互作用研究方法及其应用

1.4.1酵母双杂交系统(Yeast two hybrid system，Y2H)

1.4.2酵母双杂交系统局限性和存在的问题

1.4.3噬菌体展示技术(Phage display techniques，PDT)

1.4.4串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification，TAP)

1.4.5荧光共振能量转移

1.4.6表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)

1.4.7化学交联法(chemical cross-linking)

1.4.8免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)

1.4.9融合蛋白亲和色谱法(Protein fusion affinity chromatography)

1.4.10原子作用力显微技术(Atomic Force Microscopy，AFM)

1.4.11全基因组计算分析法

1.4.12构建相互作用模型法(Integrate networks and models)

1.4.13蛋白质芯片(Protein microarray)

1.4.14微量热技术(Microcalorimetry)

1.5本研究的目的和意义

2实验材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2培养基

2.1.3缓冲液和反应试剂

2.1.4主要分子生物学试剂

2.2方法

2.2.1基本分子生物学操作方法

2.2.2植物材料的准备

2.2.3总RNA的制备

2.2.4 RT-PCR反应

2.2.5 Real-Time PCR反应

2.2.6已知基因的克隆

2.2.7百脉根AD-cDNA文库的构建

2.2.8 GAL4 BD-SymRK诱饵质粒的构建及检测

2.2.9百脉根Y2H-AD-cDNA文库的筛选

2.2.10 β-半乳糖苷酶活性检测

2.2.11蛋白质纯化抗体制备

2.2.12 Western Bloting

2.2.13 DNA-蛋白质体相互作用外结合试验

2.2.14蛋白激酶的自磷酸化和底物磷酸化检测

2.2.15异源蛋白在洋葱表皮细胞中的瞬间表达

2.2.16分析软件及生物信息学网站

3结果与分析

3.1已知基因之间的相互作用的验证

3.2百脉根Y2H-cDNA文库的构建

3.2.1百脉根总RNA和cDNA的质量检测

3.2.2百脉根AD-cDNA文库库效率的鉴定

3.3 SymRK蛋白相互作用靶基因的筛选

3.4 SIP1基因的相关研究

3.4.1 SIP1基因的结构

3.4.2 SIP1蛋白与SymRK-PK蛋白的相互作用

3.4.3 SIP1蛋白能形成同源二聚体

3.4.4 SIP1蛋白具有结合DNA的活性

3.4.5 SIP1蛋白没有转录激活活性

3.4.6 SIP1蛋白可以结合NIN-promotor

3.4.7 SIP1和NIN基因在百脉根中的表达

3.4.8 SIP1蛋白的亚细胞定位

3.4.9 SIP1蛋白不是SymRK-PK蛋白的磷酸化底物

3.5 SIP2基因的相关研究

3.5.1 SIP2蛋白的结构分析

3.5.2 SIP2蛋白的磷酸化位点分析

3.5.3利用酵母双杂交系统验证SIP1/SIP2/SymRK蛋白之间的相互作用

3.6小结

4讨论与展望

4.1讨论

4.1.1 SymRK、SIP1、NIN三者之间的关系及其它

4.1.2 SymPK在结瘤因子信号转导中的作用及其它

4.2展望

参考文献

附录一：不同的结瘤因子的结构

附录二：本研究所用引物

附录三：SIP1的cDNA和蛋白质序列

附录四：已发表的论文

致谢