东北天南星凝集素基因的克隆及对蚜虫和褐飞虱的抗性研究

摘要

研究表明一些植物凝集素对多种害虫尤其是对同翅目类害虫有较强的抗性。为了开发更多、更有效的抗虫资源,我们对东北天南星的凝集素(Arisaema amuremse agglutinin, ArAA)进行了研究,具体实验结果如下:
　　(1)基因克隆和序列分析:根据天南星科(Arisaema)植物凝集素的保守序列设计引物,采用RACE-PCR技术从东北天南星(Arisaema amuremse)中克隆到全长为1059 bp的东北天南星的凝集素基因(araa),该基因包含780 bp完整的开放读码框序列(open reading frame, ORF),编码259个氨基酸。对ArAA的氨基酸序列、相似性、保守结构域、高级结构和甘露糖结合位点进行了分析和预测,都表明ArAA与其它已知天南星科植物凝集素十分相似。推测ArAA也具有天南星科凝集素相似的功能。
　　(2) ArAA的原核表达及蛋白纯化:将编码ArAA成熟蛋白的核苷酸序列构建入原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达重组ArAA蛋白(rArAA),并通过组氨酸标签对表达蛋白进行了纯化。
　　(3)凝血和糖凝血抑制实验:rArAA在极低的浓度(15μg/mL)时,就可以凝集兔红细胞,高浓度的rArAA使兔红细胞严重变形甚至破裂。D-甘露糖对rArAA凝集兔红细胞的凝集活性有很强的抑制作用。
　　(4) rArAA蛋白的稳定性:通过凝血活性检测rArAA的稳定性发现,rArAA蛋白有很好的热稳定性及酸碱稳定性,另外rArAA的凝血活性不依赖于二价阳离子。
　　(5) rArAA的抗虫分析:将rArAA蛋白加入到人工饲养液中,终浓度为0.1％(w/v),饲喂蚜虫(Myzus persicae(Sulzer))和褐飞虱(Nilaparvata lugens(Stal)),发现rArAA具有很好的抗蚜虫活性和抗褐飞虱活性。所以东北天南星凝集素基因(araa)在培育抗虫作物方面有潜在的应用价值。

目录

摘要

Abstract

缩略语表

1 前言

1.1 同翅目害虫的危害

1.2 植物凝集素简介

1.2.1 植物凝集素的定义

1.2.2 植物凝集素的分类

1.2.3 植物凝集素的功能

1.2.4 植物凝集素的抗虫机理

1.2.5 植物凝集素用于抗虫基因工程面临的问题

1.2.6 天南星科植物凝集素

1.3 研究的目的和意义

2. 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株和质粒

2.1.3 试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 常用溶液

2.1.6 SDS-PAGE相关溶液

2.1.7 包涵体纯化及复性相关溶液

2.1.8 ELASA相关溶液

2.1.9 Western Bloting相关溶液

2.1.10 仪器设备

2.2 方法

2.2.1 分子生物学常用操作

2.2.2 东北天南星凝集素基因(araa)的克隆

2.2.3 东北天南星凝集素基因(araa)的序列分析

2.2.4 东北天南星凝集素(ArAA)的原核表达与纯化

2.2.5 PTA多克隆抗体的制备及间接ELISA检测rArAA

2.2.6 表达产物的Western印迹分析

2.2.7 rArAA蛋白的凝血效果检测及糖结合特异性

2.2.8 rArAA的稳定性检测

2.2.9 rArAA蛋白对蚜虫的抗虫活性分析

2.2.10 rArAA蛋白对褐飞虱的抗虫活性分析

3 结果和分析

3.1 东北天南星凝集素基因(araa)的克隆及序列分析

3.1.1 东北天南星凝集素基因(araa)的克隆

3.1.2 东北天南星凝集素基因(araa)的序列分析

3.2 ArAA蛋白的原核表达与纯化

3.3 间接ELISA检测rArAA

3.4 rArAA的Western印迹分析

3.5 rArAA的凝血效果和糖结合特异性

3.5.1 rArAA的凝血效果

3.5.2 rArAA特异性结合糖

3.6 rArAA的稳定性检测

3.6.1 温度和pH对rArAA凝血活性的影响

3.6.2 二价阳离子对rArAA凝血活性的影响

3.7 rArAA蛋白抗蚜虫活性

3.8 rArAA蛋白抗褐飞虱活性

4. 讨论

参考文献

致谢